骨关节炎（OA）是一种以关节软骨进行性退化和滑膜炎症为特征的慢性疾病，因软骨自我修复能力差，临床治疗面临巨大挑战。目前关节腔内注射疗法虽创伤小，但常用药物如透明质酸（HA）半衰期短，需反复注射，依从性差且副作用风险高。为满足长期治疗需求，研究人员聚焦于兼具生物相容性与功能活性的新型生物材料。软骨脱细胞外基质（dECM）因保留天然成分与三维结构，可模拟微环境、促进细胞功能恢复，是理想修复载体；而干细胞外泌体（MSC-EXO）虽富含生物活性分子，能调节免疫、抑制炎症、促进软骨再生，但其靶向性不足、关节腔内滞留率低，限制了疗效。尽管已有研究结合软骨靶向外泌体与缓释系统，但其制备过程复杂、依赖专业设备，可能破坏外泌体结构，从而限制临床转化潜力。

针对上述问题，四川大学张兴栋院士团队王启光/樊渝江课题组提出了一种基于“自组装双功能外泌体”的创新策略。研究团队利用软骨细胞结合肽（CAP-SH）与II型胶原结合肽（WL-SH）对脐带间充质干细胞来源的外泌体进行表面修饰，赋予其靶向软骨组织及与脱细胞细胞外基质（dECM）特异性结合的能力，从而显著简化了构建负载功能化外泌体的仿生软骨微凝胶缓释系统的流程（图1）。该系统不仅实现了外泌体的精准递送与长效滞留，还成功模拟天然软骨微环境，协同促进软骨细胞活力、基质合成并抑制肥大，为骨关节炎的精准治疗提供了新思路，具有显著的科学价值与临床转化潜力。相关成果以题为“Self-assembled bifunctional exosomes simplify chondrocyte-targeted sustained-release systems in decellularized cartilage microgels for synergistic osteoarthritis therapy”发表于《Small》。王启光副研究员和樊渝江教授为通讯作者，四川大学生物医学工程学院硕士研究生邓偲焱和陈曦为共同第一作者。研究获国家自然科学基金（32071353）和四川省自然科学基金（2024NSFSC0671）资助。

图1 自组装双功能修饰外泌体用于增强软骨细胞靶向及在脱细胞基质微凝胶中缓释的协同骨关节炎治疗示意图

为构建具有双重软骨靶向能力的双功能修饰外泌体，研究采用脐带间充质干细胞来源的外泌体（EXO），经表面修饰软骨细胞亲和肽（CAP）和II型胶原结合肽（WL）。设计合成的多肽聚合物由PEG连接胆固醇与靶向肽，胆固醇可自组装嵌入外泌体膜，使CAP与WL肽段暴露于外泌体表面，从而增强其对软骨细胞及II型胶原的靶向结合能力（图2）。表征结果显示，经优化修饰比例后的双功能修饰外泌体（M-EXO）和仅CAP修饰的软骨细胞靶向性外泌体（T-EXO），其粒径与电位较EXO略有增加，但仍保持与天然外泌体相似的物理特性。体外实验中，将DIO荧光标记的外泌体与软骨细胞或L929细胞共孵育2小时后观察，T-EXO与M-EXO组在软骨细胞内的绿色荧光聚集显著增强，半定量分析进一步证实M-EXO对软骨细胞的结合能力略高于T-EXO；而在非靶细胞L929中，各组外泌体的摄取效率无显著差异，表明M-EXO在体外具有显著的软骨细胞靶向特异性。

图2. 双功能修饰外泌体的构建及体外验证

体内实验中，将DIR标记的外泌体注射入大鼠膝关节，活体成像显示天然EXO的荧光信号迅速衰减，而M-EXO滞留时间最长，T-EXO次之（图3）。半定量分析证实WL肽聚合物显著增强了外泌体与软骨组织的结合能力，并协同提升了CAP肽的靶向效果。注射2天后，天然EXO组肝脏出现明显荧光聚集，而T-EXO与M-EXO组各器官未见显著荧光信号。共聚焦显微镜观察显示，M-EXO在关节表面及横截面均呈现大量绿色荧光，T-EXO表面荧光较少、横截面少量分布，EXO组荧光最弱；半定量分析表明M-EXO的富集量约为T-EXO的3倍。综上，WL与CAP聚合物赋予外泌体双重软骨靶向能力，M-EXO相较于T-EXO更易滞留于组织表面并穿透软骨层，主要定位于中层区域，归因于其优先结合软骨内胶原纤维，继而深入组织靶向软骨细胞，从而在体内实现更高的滞留率。

图3. 双功能修饰增强外泌体在体内软骨部位的滞留

为构建可负载外泌体的微凝胶缓释系统，研究制备了由HA与dECM组成的HECM微凝胶，经脱水处理后，M-EXO通过其表面WL肽聚合物与II型胶原稳定结合，实现高效负载并抑制快速扩散，随微凝胶降解持续释放（图4）。微凝胶采用微流控技术与紫外交联制备，粒径均一（约120 μm），具备良好可注射性；干燥后溶胀迅速，负载率优化至62.7%，共聚焦显微镜显示M-EXO分布均匀。体外释放实验表明，M-EXO在PBS中释放平稳，15天累计释放约52%；在胶原酶存在下，其释放速率与微凝胶降解曲线高度一致，显著优于未修饰组。体内实验通过大鼠关节腔注射HECM@M-EXO，IVIS成像显示其荧光信号滞留时间显著延长，至第11天仍保持较强信号，而对照组在第7天已明显减弱，半定量分析进一步证实M-EXO组信号衰减更慢。

图4. 用于外泌体靶向缓释的HECM微凝胶的制备与表征

为评估HECM@M-EXO对骨关节炎（OA）软骨细胞的修复作用，研究采用IL-1诱导的OA软骨细胞模型，结合模拟体内释放的提取物进行实验（图5）。活/死染色与CCK8结果显示，HECM@M-EXO显著提升细胞存活率与增殖能力，同时改善细胞形态、抑制肥大。甲苯胺蓝与番红O染色表明，HECM@M-EXO有效促进软骨特异性胞外基质分泌，糖胺聚糖（GAG）合成显著增强，且细胞数量与基质合成能力同步提升。免疫荧光与qPCR分析进一步证实，HECM@M-EXO上调COL2、SOX9、AGG等软骨基质关键基因，同时下调COL10、COL1、MMP13等与肥大、纤维化及基质降解相关的基因表达。综合来看，HECM@M-EXO不仅促进OA软骨细胞增殖、抑制异常肥大，还能模拟健康软骨微环境，增强ECM合成与分泌，展现出良好的治疗潜力。

图5. HECM@M-EXO在体外促进OA软骨细胞的功能恢复及基质合成，并调控OA相关蛋白与基因功能。

研究在大鼠骨关节炎（OA）模型中评估了HECM、M-EXO及HECM@M-EXO的治疗效果（图6）。Micro-CT结果显示，PBS组关节严重磨损，而HECM@M-EXO组关节结构接近健康状态，关节宽度与间隙宽度显著优于其他组，有效延缓OA进展。大体观察与评分表明，HECM@M-EXO组软骨形态最接近自然组织，疗效最佳，体现了HECM与M-EXO的协同作用。组织学染色进一步证实，HECM@M-EXO组软骨细胞排列规则、基质丰富均匀、表面光滑，Makin评分最优，显示其在促进透明软骨再生与维持结构完整性方面具有显著优势。主要器官病理检查未见明显损伤，表明该治疗方案具有良好的长期生物相容性。

图6. HECM@M-EXO对大鼠膝关节大体形态及结构的修复作用，并有效缓解骨关节炎进展、促进软骨特异性基质分泌

为探究HECM@M-EXO促进骨关节炎恢复的分子机制，研究对4周动物样本进行转录组学分析（图7）。GO与KEGG富集分析显示，HECM组显著上调与细胞外基质合成、细胞黏附及炎症调控（如NF-κB通路）相关的基因，表明其具有促进基质合成与抗炎作用；而HECM@M-EXO组进一步调控基质合成、免疫反应及关键信号通路（如MAPK、PI3K/AKT），显著促进软骨透明化与细胞功能恢复。火山图与热图分析显示，HECM@M-EXO组共调控1329个差异基因（543上调、786下调），HECM组相较PBS组调控1680个基因（1117上调、563下调），提示M-EXO的缓释作用显著影响基因表达网络。机制上，HECM@M-EXO通过胆固醇-PEG-肽聚合物修饰实现软骨细胞与II型胶原双重靶向，结合微凝胶缓释系统延长局部滞留，协同干细胞外泌体与脱细胞软骨基质改善微环境，促进软骨再生。

图7. 转录组学分析揭示了骨关节炎治疗效果背后的分子机制

这项工作是该团队在工程化外泌体平台构建领域的最新进展。该研究创新性地提出了一种基于自组装双功能修饰策略的软骨细胞靶向缓释系统，大幅简化了可注射制剂的构建流程，为骨关节炎的关节腔内治疗提供了新思路。通过将软骨细胞靶向肽与II型胶原结合肽自组装于外泌体膜，显著提升了外泌体与软骨细胞的结合效率，并实现了其在由软骨脱细胞基质与透明质酸构成的微凝胶中的高效包封。该系统不仅显著延长了外泌体在关节腔内的滞留时间，还通过调控PI3K/AKT信号通路，有效促进软骨再生、抑制炎症并防止细胞外基质降解。因此，这种融合仿生微环境与靶向干细胞外泌体的自组装系统，为骨关节炎的治疗提供了一种兼具创新性与临床转化潜力的新策略。

参考文献：

Siyan Deng#, Xi Chen#, Hongfu Cao, Manyu Chen, Wenqing Shi, Na Li, Jie Liang, Yujiang Fan*, Qiguang Wang*, Xingdong Zhang. “Self-Assembled Bifunctional Exosomes Simplify Chondrocyte-Targeted Sustained-Release Systems in Decellularized Cartilage Microgels for Synergistic Osteoarthritis Therapy.”Small (2025): e03492. 

原文链接：

https://doi.org/10.1002/smll.202503492

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