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本文报告了首例发生于NF2相关神经鞘瘤病（NF2-SWN）患儿、且无任何环境石棉暴露史的胸膜间皮瘤（PM）病例。间皮瘤是脑肿瘤患者中罕见的继发性肿瘤，与NF2-SWN的关联仅在少数个案中被描述过，且从未见于儿童领域。NF2-SWN是一种由NF2肿瘤抑制基因失活胚系突变引起的常染色体显性遗传病，该基因也是人类原发性间皮瘤最常见的突变相关基因之一。通过MLPA检测、array-CGH分析以及针对血液和肿瘤DNA的NGS测序，研究人员确定了这一罕见的NF2驱动型PM的突变谱，并在肿瘤细胞中发现了若干非典型染色体畸变，提示儿童与成人间皮瘤之间存在不同的基因组特征。

背 景

间皮瘤主要起源于覆盖胸膜、腹膜和心包腔的浆膜层的间皮细胞，可分为良性和恶性两种类型。胸膜间皮瘤（PM）是一种侵袭性罕见疾病，在意大利的发病率约为每 10 万居民 2.46 例，是间皮瘤最常见的形式，约占该肿瘤病例的 80%。根据组织学类型，从预后较好到较差，可分为上皮样型、双相型和肉瘤样型。胸膜间皮瘤主要与工业污染物和矿物纤维暴露有关，约 85% 的病例与石棉相关。尽管石棉无疑是间皮瘤最大且最广为人知的病因，但约 20% 的患者并无任何已知暴露史。遗传学分析及其他研究使人们怀疑遗传易感性和放疗是其他可能的致病因素。

在无已知暴露史的PM患者中，携带特定遗传性基因突变者不足 1%。这些遗传性间皮瘤发病年龄更轻，且无性别或特定解剖部位偏好。此外，可能并存的其他癌症（尤其是黑色素瘤和肾细胞癌）提示存在更广泛的癌症易感综合征。为了成功开发诊断性、预后性和个体化治疗方案，理解驱动PM的遗传改变至关重要。由于PM是一种罕见疾病，基因组研究十分有限，仅涉及少量病例。BAP1、NF2和CDKN2A的功能缺失突变此前已在PM中被描述，其他研究还报告了涉及基因组多个不同区域的拷贝数增加和拷贝数缺失。最近的全基因组测序分析发现了PM中新的显著突变基因，包括RDX、PIK3C2B、TAOK1、TP53、DDX3X、SETD2、SF3B1和TRAF7。

间皮瘤在儿童中极为罕见，通常与石棉暴露无关，且与成人型存在一些临床差异。此外，儿童间皮瘤的预后似乎优于成人型。中位发病年龄为 13.4 岁。

NF2（2型神经纤维瘤病）相关神经鞘瘤病（NF2-SWN）是一种常染色体显性遗传病，其特征包括多发性神经系统肿瘤（前庭神经鞘瘤、颅内脑膜瘤、脊髓室管膜瘤和周围神经肿瘤）、眼部异常和皮肤病变。与NF2-SWN相关的肿瘤是由NF2肿瘤抑制基因的失活突变或两个等位基因（体质性突变和体细胞突变）的缺失引起的。NF2表达Merlin蛋白，这是一种ERM（埃兹蛋白–根蛋白–膜突蛋白）样分子，与参与细胞骨架动力学和离子转运调节的细胞表面蛋白相互作用。NF2突变也可在散发性神经鞘瘤、脑膜瘤以及——特殊的是——散发性恶性间皮瘤中检测到，表明NF2基因可能是所有这些细胞类型的关键生长调控因子。尽管间皮瘤并非NF2-SWN的特征性表现，但由于两种疾病均属罕见，NF2-SWN中间皮瘤的高患病率仍可能未被发现。已有研究提示NF2-SWN患者发生间皮瘤的风险可能增加，但实际上，遗传性NF2-SWN患者很少发生间皮瘤作为第二肿瘤，且报告的少数病例均发生在成年期。

本文报告首例已知的儿童病例——在 1 岁时被诊断为综合征型NF2-SWN，12 年后发展为PM。研究人员鉴检出一个胚系NF2功能缺失突变，并且在PM中发现了第二次打击——22号染色体上NF2位点的缺失，导致NF2双等位基因失活，同时伴有多种其他数目性染色体变异，其中一些对于PM的遗传谱而言并不常见。

研究结果

患者信息

一名 1 岁男童被诊断为重度NF2相关神经鞘瘤病，接受了多次神经外科切除术（脑部和脊髓脑膜瘤及前庭神经鞘瘤）以及多线化疗（羟基脲、贝伐珠单抗和西罗莫司），后者均被证实无效。12 年后，他出现胸腔积液和体重减轻。CT扫描显示右侧胸膜增厚及多个腹膜结节（图1A）。胸腔穿刺细胞学检查诊断为上皮样型胸膜间皮瘤，病程较为缓和，总生存期约一年；随后患者因与NF2-SWN相关的脑膜瘤快速增多而死亡（图1B）。重要的是，患者无肿瘤家族史，也无环境石棉污染暴露史。

图1（A）腹部计算机断层扫描（横断面），显示胸膜增厚和积液（黄色星号）；（B）脑部 MRI（T1 增强轴位），显示双侧复发性脑膜瘤迅速增大（黄色箭头）

NF2相关神经鞘瘤病的分子诊断

通过NGS对患者基因组DNA中三个NF2-SWN相关基因（NF2、LZTR1和SMARCB1）进行检测，未发现致病性单核苷酸变异（SNV）和小片段插入/缺失。然而，通过MLPA检测（多重连接依赖性探针扩增），发现NF2基因（NM_000268.3）存在一个杂合性缺失，该缺失涵盖5'UTR（起始密码子前414 bp）和外显子1（图2A，B），从而证实了临床诊断。

图2 患者基因组DNA的MLPA分析

利用阵列比较基因组杂交技术（Array-CGH）对间皮瘤细胞进行基因组谱分析

由于PM是一种常以典型染色体异常为特征的肿瘤，研究人员通过a-CGH对患者PM积液细胞的DNA进行了分析，发现整条6、10、11、16和20号染色体获得，以及整条14、22和Y染色体缺失（图3）。

图3 通过阵列比较基因组杂交技术从患者间皮瘤活检（渗出细胞）中提取的 DNA 获得的基因组图谱，显示 6、10、11、16 和 20 号染色体重复，14、22 和 Y 号染色体缺失

利用NGS进行间皮瘤细胞基因组分析

为了评估肿瘤的完整突变谱，使用NGS panel对间皮瘤积液细胞提取的DNA进行了NGS检测。分析未在癌症相关基因中发现任何致病性SNV，但发现了大量拷贝数变异（CNV），这些结果基本证实了a-CGH的结果（表1）以及NF2位点的体细胞缺失。NF2的第二次打击证实了该肿瘤抑制基因作为PM驱动因子的作用。分析还识别出肿瘤中常见的共存突变，这些突变可能激活互补的致癌通路，例如位于14q染色体上的PARP2、FANCM、RAD51B、MLH3、DICER1和XRCC3，以及位于22q染色体上的MAPK1、SMARCB1、CHEK2、NF2和EP300，除NF2外，这些基因的功能目前尚不完全清楚是否与PM明确相关。

表1 肿瘤DNA中显示CNV的基因和染色体

讨 论

NF2-SWN和PM均与NF2功能异常相关；因此，NF2患者发生PM的风险可能增加。然而，迄今为止，文献中仅报告了极少数同时诊断为NF2和恶性间皮瘤的病例，且均为成人。NF2突变也与腹膜和心包间皮瘤相关。在腹膜间皮瘤病例中，NF2突变检出率为 21%–35%。原发性心包间皮瘤极为罕见，占所有间皮瘤的比例不足 1%，其基因组变异与腹膜间皮瘤相似，由包括NF2在内的多个基因驱动。

本文描述首例儿童病例：一名NF2-SWN患儿在 12 年后，即 13 岁时发展为PM。此外，患者从未接触过石棉污染，也无肿瘤家族史。研究人员在血液DNA中检出一个致病性NF2杂合缺失，同时在肿瘤中通过整条22号染色体的缺失发现了NF2位点的伴随缺失，证明PM是由NF2双等位基因功能缺失驱动的。在成人中，间皮瘤细胞中的NF2失活被认为是晚期事件，可能导致侵袭性表型。在此研究人员提出，在儿童间皮瘤中，NF2失活可能反而代表一个早期驱动事件。

肿瘤DNA的NGS分析显示存在多个CNV，基本与a-CGH识别的数目性染色体畸变一致。除14号和22号染色体缺失外，发现的其他染色体变异并非间皮瘤的典型特征。特别是，间皮瘤的主要特征是染色体p臂或q臂的缺失而非获得，而本文患者仅有整条染色体受累，且获得的染色体远多于丢失的染色体。可以推测，NF2基因的缺失，以及染色体上其他抑癌基因的缺失或致癌基因的重复（分别发生在丢失或获得的染色体上），可能共同作用导致该患者的病变，而这些异常此前尚未在间皮瘤中发现。

具体而言，NGS分析除了NF2外，还突出了十个癌症相关基因（PARP2、FANCM、RAD51B、MLH3、DICER1、XRCC3、MAPK1、SMARCB1、CHEK2和EP300），这些基因的缺失是否与PM相关目前尚未得到明确证实。虽然PM与MAPK通路基因（如MAPK1）或EP300的相关性已有较充分的描述，而对于CHEK2、FANCM、XRCC3和SMARCB1，已有一些相关提示。RAD51B和MLH3无疑值得关注，且尚未被报道与PM相关，两者对DNA错配修复均至关重要。

多项研究采用Sanger测序、全基因组关联分析（GWAS）和全基因组测序等多种技术，对与PM相关的基因和遗传机制进行了探索。在成人PM中，mTOR、Hippo（NF2）和p53的致癌通路主要与肿瘤相关。BAP1、CDKN2A、CDKN2B、NF2、MTAP、TP53和SETD2的改变发生率至少为 10%。反复出现的染色体改变包括1p和3p的部分缺失以及14、18、19和22号染色体的单体。儿童PM是一种极为罕见的疾病，文献中发表的病例极少。它似乎是一种与成人型不同的实体，因为它从未与石棉或放射暴露相关。最近，儿童恶性腹膜间皮瘤病例已得到遗传学研究，观察到ALK、EWSR1、FUS1、YY1或AURKA、AURKC、HLA-1B、ZNF-217、OR5F1和MEN1基因的改变，但BAP1未见改变。

虽然大多数PM源于环境致癌因素暴露，潜伏期长达约 30–60 年，但少数病例由体细胞或胚系变异自发产生。与BAP1遗传性胚系变异相关的成人PM发病年龄更年轻，为 55 岁 vs. 72 岁。至于NF2，尽管许多NF2患者已达到间皮瘤发病年龄，但间皮瘤的发生并未被特别报道，提示NF2胚系突变不太可能像BAP1那样成为家族性PM发生的易感因素。

因此，本文检出的所有癌症基因——甚至其他尚未描述的基因——都可能构成无环境污染情况下青少年PM发生的潜在遗传风险因素。未来需要进一步的补充研究和功能学研究，以了解哪些基因可能与儿童胸膜间皮瘤的恶性演变优先相关。

研究材料和方法

样品采集

使用试剂盒从患者外周血淋巴细胞和胸腔积液细胞中提取基因组DNA和PM DNA，操作均按照制造商说明书进行。

NF2-SWN相关基因的靶向二代测序（NGS）

对基因组DNA进行三个NF2-SWN相关基因的测序分析。鉴于2型神经纤维瘤病与神经鞘瘤病之间存在临床重叠，开发了一个定制化NGS panel，以靶向NF2（NM_000268.3）、LZTR1（NM_006767）和SMARCB1（NM_003073.3）的完整编码序列（CDS）及相邻内含子区域的 10 个碱基。引物池由 117 个扩增子组成，具有以下特征：总覆盖度 100%，无缺失区域，扩增子范围为 125–275 bp。

多重连接依赖性探针扩增分析（MLPA）

使用MLPA探针对基因组DNA进行分析，以鉴定NF2基因内部的单外显子和多外显子缺失/重复。获得的结果使用Coffalyser Net软件（版本v.240129.1959，MRC Holland）进行分析。患者与对照样本标准化峰高比值的平均截断值：外显子缺失时低于 0.7，外显子重复时高于 1.30。

阵列比较基因组杂交（a-CGH）基因组谱分析

使用试剂盒对PM积液细胞DNA进行高分辨率寡核苷酸a-CGH检测，平均分辨率为25 kb。每次杂交产生的图像使用Agilent Feature Extraction 10.5软件进行处理，获得的数据使用Genomic Workbench 7.0.40软件（Agilent）进行分析，如前所述。

癌症相关基因的靶向NGS

使用OCA Plus对肿瘤DNA进行全面的分子分析。该panel可在同一工作流程中检测端粒等位基因失衡（TAI）、大规模状态转换（LST）、微卫星不稳定性（MSI）、肿瘤突变负荷（TMB）和HRD（同源重组修复缺陷）。通常，使用约 20 ng的核酸浓度作为起始量进行多重PCR扩增。按照制造商说明书上样手动制备的文库，并使用试剂盒进行定量。所有文库在模板制备前调整至 50 pM，并按照制造商说明书上样。获得 >1000× 的中位覆盖度并检测最小等位基因频率（MAF）为 1% 的变异。

生物信息学分析

BAM文件使用Ion Reporter™ Software 5.20版以及Oncomine Comprehensive Plus-w3.1-DNA和Fusions-Single Sample工作流程进行分析。变异最终根据分子病理学协会、美国临床肿瘤学会和美国病理学家学院联合共识推荐的分层系统进行分类。拷贝数评估使用专有的VCIB（变异性控制信息学生物信息学基线）算法进行。VCIB生物信息学基线使用至少 48 个多样本（其中至少 6 个正常样本）创建。MAPD指标是衡量panel中所有扩增子检测到的reads覆盖噪声的指标。MAPD值越高通常意味着覆盖均匀性越低。覆盖均匀性较低可能导致CNV检出遗漏或错误。MAPD分数可在可下载的VCF文件中查看，或在单样本扩展分析结果的审查中查看。进行CNV判读需满足以下标准：MAPD <0.3；p值 <0.05。对于拷贝数扩增，log2比值必须 >2；对于拷贝数缺失，log2比值必须 <-2。此外，对于拷贝数扩增，p值必须 >0.85；对于拷贝数缺失，p值必须 <0.15。

结 论

总之，本文报告了首例已知同时患有NF2-SWN和PM的儿童病例的遗传学研究，提示其可能存在与成人型不同的基因组特征。事实上，除NF2位点缺失（导致严重神经鞘瘤病的病因）以及14号和22号染色体缺失外，本文患者并未表现出与成人PM经典相关的基因突变。因此，需要进一步的研究来确定哪些基因可能与儿童PM特异性相关，以便开展针对性的分子靶向治疗策略。

参考文献：

Ognibene, M.; Piccolo, G.; Crocco, M.; Di Duca, M.; Verrico, A.; Molteni, M.; Romano, F.; Capra, V.; Rossi, A.; Zara, F.; et al. Genetic Landscape of a Pleural Mesothelioma in a Child Affected by NF2-Related Schwannomatosis. Int. J. Mol. Sci. 2025, 26, 6848. https://doi.org/10.3390/ijms26146848

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