在自然界中，RNA引导系统通过蛋白质与引导RNA的结合，能够靶向特定的核酸序列，从而实现多样化的生物学功能。例如，在细菌和古菌中，CRISPR-Cas系统可以根据CRISPR数组中的RNA引导序列识别并切割移动遗传元件（MGEs）的DNA或RNA，而真核生物中的小RNA（如miRNA和piRNA）则通过与目标RNA的相互作用来调节基因表达。此外，snoRNA（小核仁RNA）在真核生物和古菌中指导RNA的甲基化和假尿苷化，并参与核糖体生物发生。这些RNA引导系统因其易于编程的特性，在实验室中被开发为分子工具，尤其是CRISPR-Cas系统在过去十年中彻底改变了基因组编辑、表观基因组编辑、RNA编辑、调控和检测等领域。然而，尽管已知的RNA引导系统种类繁多，但为了进一步扩展其多样性，需要更通用的数据库挖掘方法。本文通过整合结构挖掘、序列轮廓挖掘以及基于社区检测的蛋白质嵌入聚类，发现了一类主要由噬菌体、古菌病毒和寄生细菌编码的多样化RNA引导系统家族——TIGR（Tandem Interspaced Guide RNA）系统。

美国外籍院士麻省理工张锋揭示TIGR系统的发现、生化特性、结构分析以及其在基因编辑中的潜在应用，为理解RNA引导系统的起源和进化提供新的视角，并为开发新型基因编辑工具奠定基础。相关内容以“TIGR-Tas: A family of modular RNA-guided DNA-targeting systems in prokaryotes and their viruses”为题发表在《Science》上。

【主要内容】

图1 TIGR系统的发现和基因组组织

研究人员通过结构挖掘，利用SpCas9的RNA结合域作为起点，发现了与IS110转座子的结构相似性，并进一步挖掘出与Nop结构域相关的TIGR系统。图中还展示了TIGR系统中Tas蛋白的结构模型和基因组定位，以及TIGR数组的序列组成。这些信息揭示了TIGR系统的独特基因组组织和其编码蛋白的结构特征，为后续研究奠定了基础。

图2TIGR数组的转录和加工

研究人员通过小RNA测序实验，发现TIGR数组被转录并加工成36个核苷酸的tigRNA单元。这些tigRNA单元从TIGR数组的边缘重复序列开始，经过间隔区A、环重复序列和间隔区B，最终在第二个边缘重复序列的中间结束。图中还展示了不同实验条件下tigRNA的加工情况，包括野生型和突变型TasR蛋白对tigRNA加工的影响，以及最小化TIGR数组的加工效率。这些结果表明Tas蛋白能够特异性地结合并加工tigRNA，为TIGR系统的功能实现提供了关键的分子基础。

图3 TasR核酸酶靶点的鉴定

研究人员通过在大肠杆菌中表达TasR蛋白，并利用基因组测序技术，发现TasR能够特异性地结合并切割与tigRNA互补的DNA序列。图中展示了TasR蛋白与DNA靶点的结合位点，以及在体外实验中TasR对合成DNA底物的切割活性。这些实验结果揭示了TIGR系统中tigRNA如何指导TasR蛋白识别和切割目标DNA，为理解TIGR系统的RNA引导机制提供了重要依据。

图4 TIGR-TasR的DNA靶向规则

研究人员通过体外切割实验和序列分析，发现TasR蛋白能够通过tigRNA的两个间隔区（A和B）同时靶向DNA的两条链。这种双链靶向机制与CRISPR-Cas9系统的单链靶向模式截然不同。图中还展示了TasR蛋白对不同突变DNA底物的切割活性，揭示了tigRNA间隔区与目标DNA之间的碱基配对规则，以及TasR蛋白对DNA切割的特异性要求。这些发现为TIGR系统的精确基因编辑应用提供了理论基础。

图5 人类基因组编辑中的TIGR-TasR应用

研究人员通过在人类细胞系HEK293FT中表达TasR蛋白和tigRNA，成功实现了对人类基因组中多个靶点的编辑。图中展示了不同TasR蛋白（包括TaTasR和ParTasR）在多个基因位点上的编辑效率，以及编辑产生的插入和缺失（indel）模式。这些结果表明TIGR-TasR系统具有潜在的基因编辑能力，为开发新型基因编辑工具提供了实验依据。

图6 TIGR-TasR的结构基础

研究人员通过冷冻电镜技术解析了TasR蛋白与tigRNA和DNA底物的复合物结构。图中展示了TasR蛋白的二聚体结构，以及tigRNA和DNA底物在复合物中的结合方式。TasR蛋白通过其RuvC结构域切割DNA，而tigRNA则通过其两个间隔区与DNA的两条链形成互补配对。这种结构揭示了TIGR系统的RNA引导DNA切割机制，并为理解其独特的靶向规则提供了分子层面的解释。

图7 TIGR系统的进化和功能多样性

研究人员通过系统发育分析，展示了TIGR系统与IS110转座子和box C/D snoRNA之间的进化关系。图中还展示了TIGR系统中不同类型的数组结构，包括双重复数组和茎环数组，并分析了这些数组的序列特征和功能。这些发现揭示了TIGR系统的进化起源和其在不同生物中的功能多样性，为开发基于TIGR系统的新型基因编辑工具提供了重要的进化背景。

【全文总结】

TIGR系统的发现不仅扩展了RNA引导系统的多样性，还为基因编辑工具的开发提供了新的资源。与CRISPR系统相比，TIGR系统具有独特的靶向规则和结构特征，例如不需要PAM序列、能够同时靶向DNA的两条链等，这些特性使其在基因编辑应用中具有潜在的优势。此外，TIGR系统与IS110转座子和box C/D snoRNA之间的进化联系也为理解RNA引导系统的起源和进化提供了新的视角。

原文链接：

10.1126/science.adv9789

Tags： 张锋院士，最新Science，揭示RNA引导DNA靶向的全新机制