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循环肿瘤DNA（ctDNA）在淋巴瘤中的研究日益增多，因为它能够实现非侵入性分子谱分析、克隆演化的纵向评估以及微小残留病（MRD）的定量检测，后者可反映残留肿瘤负荷和治疗反应，并作为临床验证的预后生物标志物。ctDNA的临床用途包括辅助诊断、早期发现复发以及解决影像学结果不明确的问题。目前淋巴瘤中ctDNA评估的方法包括数字PCR、免疫球蛋白克隆型测序、带唯一分子标识符或双链条形码的杂交捕获二代测序，以及分阶段测序。将ctDNA建立为临床级别的检测方法，需要从血液采集、血浆处理、cfDNA提取、定量到经分析验证的基因分型和MRD测量等所有技术步骤进行严格的质量控制和标准化。正在进行的大型前瞻性试验和国际标准化工作旨在将基于ctDNA的MRD评估定义为淋巴瘤治疗中可重复且临床可操作的工具。

《Blood Advances》近日发表综述，概述了淋巴瘤ctDNA评估的关键分析前和分析工作流程，并讨论了该领域尚未解决的挑战和未来方向。

引言

循环肿瘤DNA(ctDNA)在实体瘤中已达到临床成熟，FDA批准的伴随诊断可用于检测可操作突变，指导肺癌、乳腺癌和前列腺癌的靶向治疗。除治疗选择外，ctDNA在治愈性治疗后的微小残留病检测中显示出高临床有效性，术后ctDNA阳性可强烈预测多种肿瘤类型的复发风险。此外，ctDNA还能够纵向监测治疗反应和早期检测耐药突变。

游离DNA(cfDNA)已在多种血液系统恶性肿瘤中得到研究。在髓系肿瘤和白血病中的研究表明，cfDNA的贡献有限，仅限于对循环恶性细胞的分型。相比之下，淋巴瘤通常缺乏循环中的癌细胞，使得cfDNA成为非侵入性分子谱分析、疾病监测和微小残留病（MRD）检测的特别有价值的工具。因此本综述将聚焦于淋巴瘤，因为在血液系统恶性肿瘤中，cfDNA在淋巴瘤中的转化和临床研究最为广泛。

确保用于ctDNA分析的最佳样本质量

健康和患病状态下游离DNA 的生物学起源和消除机制直接决定了分析前样本处理的必要要求（表1）。

表1. 健康和疾病状态下游离DNA的来源与清除：对分析前处理的意义

领域	关键点	对 cfDNA/ctDNA 分析的意义
fDNA 的生理起源	cfDNA 来源于正常细胞更新，主要是凋亡的造血细胞。片段主要为双链、与核小体相关、与组蛋白结合，长度约 165 bp。妊娠期，胎儿/胎盘 DNA 也贡献于血浆 cfDNA。	确立了健康个体中存在基线背景 cfDNA。
生理动力学	cfDNA 半衰期短（数分钟至数小时），血浆稳态浓度低（1–10   ng/mL）。快速清除维持低背景水平。	支持 cfDNA 作为反映实时生物学变化的动态生物标志物。
ctDNA 的定义	在癌症患者中，一部分 cfDNA 来源于肿瘤细胞，称为循环肿瘤 DNA（ctDNA）。	ctDNA 代表血浆中可测量的肿瘤来源成分。
ctDNA 可检测性的决定因素	ctDNA 水平取决于肿瘤生物学、肿瘤负荷、微环境和宿主清除机制。	检测灵敏度在不同患者和疾病状态下差异显著。
肿瘤负荷与分期	较大的肿瘤和转移/播散性疾病因细胞更新率更高而释放更多 ctDNA。早期或非常小的肿瘤可能产生低于检测限的 ctDNA。	晚期癌症通常比局限性疾病的检测灵敏度更高。
肿瘤位置与血管化	高度血管化的器官（如肝、肺）释放更多 ctDNA；免疫豁免部位（如脑）释放较少。	解剖部位影响血浆 ctDNA 丰度。
肿瘤生物学	高增殖、凋亡、坏死、缺氧、基因组不稳定性和侵袭性生物学行为增加 ctDNA 释放。优势肿瘤克隆比次要亚克隆贡献更多 ctDNA。	ctDNA 水平可能反映肿瘤侵袭性和克隆结构。
治疗相关的 ctDNA 变化	治疗诱导的肿瘤细胞死亡可导致 ctDNA 水平一过性升高。	相对于治疗的采血时机对结果解读很重要。
典型的 ctDNA 占比	早期癌症：通常 <1% 的总 cfDNA。晚期/转移性癌症：通常 1–10%。高度侵袭性肿瘤：可能超过 50%。	检测灵敏度要求取决于疾病背景。
肾脏清除	小的、不与蛋白结合的 cfDNA 片段（~150–200 bp）可被滤过并随尿液排出。	肾功能不全可能增加背景 cfDNA 水平。
肝脏/巨噬细胞清除	枯否细胞和肝脏巨噬细胞摄取并降解 cfDNA。	肝功能不全可能损害 cfDNA 清除。
酶降解	DNase（如 DNASE1L3）在血浆/细胞外液中降解 cfDNA。较短片段清除更快；与核小体结合的片段更具抵抗力。	片段大小和染色质结合影响 cfDNA 的持久性。
生理调节因素	昼夜节律和禁食影响极小。剧烈运动可使 cfDNA 一过性升高数倍，通常在 30–60 分钟内恢复正常。	可行时应标准化运动时间。
炎症与组织损伤	创伤和炎症状态增加背景 cfDNA 产生。	升高的正常 cfDNA 可能稀释 ctDNA，降低可检测性。
妊娠相关混杂因素	胎盘 cfDNA 引入父系遗传变异，可能模拟肿瘤突变。	存在假阳性变异解读的风险。
移植相关混杂因素	器官移植受者可能携带供者来源的 cfDNA。在异基因干细胞移植受者中，循环造血 DNA 为供者来源，而肿瘤突变仍为受者来源。	在移植背景下，胚系变异和 CH 的解读变得复杂。
克隆性造血	CH 突变（如 DNMT3A、TET2、ASXL1、TP53、JAK2、SF3B1、PPM1D）来源于非恶性造血克隆，可能出现在血浆 cfDNA 中。	血浆假阳性变异的主要来源。
识别 CH 的方法	将血浆 cfDNA 与匹配的白细胞 DNA 进行比较；相似的变异等位基因频率强烈提示 CH 起源。评估基因背景、肿瘤相关性、VAF 稳定性、患者年龄和纵向行为。生物信息学 CH 分类器可能有帮助。	并行白细胞测序被认为是金标准。
分析前建议	可行时标准化采血条件。避免在剧烈运动后或急性炎症期间采样。保持系列样本之间的一致性。	减少生物学变异性，改善纵向解读。
系列监测的重要性	ctDNA 的相对变化随时间推移通常比绝对值提供更多信息。	纵向采样对于 MRD 和反应评估具有临床价值。
胚系 DNA 的来源	需要无肿瘤的 DNA 来区分体细胞变异与遗传变异及 CH。在异基因干细胞移植中，非造血组织（如皮肤成纤维细胞、毛囊）需要作为胚系对照。	胚系比较物的选择取决于移植状态。
移植中的 CH 检测	在器官或干细胞移植后，应评估供者来源的血细胞是否存在 CH。	准确解读血浆变异所必需。
基线基因分型：肿瘤组织 vs 血浆	肿瘤组织提供了更优的初始变异回收率和更高的 MRD 灵敏度。血浆捕获空间异质性并确认 ctDNA 可检测性。	组织知情 MRD 检测通常优于仅血浆方法。
组织活检的局限性	核心针活检可能产生有限的 DNA；FFPE 处理可能降解 DNA 并损害测序质量。	组织可能不足或技术上不理想。
浆基因分型的优势	由于肿瘤异质性，血浆可能识别出活检中不存在的突变（约 20% 的患者）。少数 DLBCL 患者（1–5%）尽管存在疾病，ctDNA 仍可能检测不到。	血浆是组织分析的补充。
当前证据缺口	缺乏在淋巴瘤中对组织知情与血浆知情 MRD 策略的直接前瞻性比较。	最佳基线策略仍不确定。

为最小化分析前变异、最大化ctDNA产量并确保肿瘤特异性基因组改变的准确检测，专家共识和最佳实践都推荐了标准化的分析前流程，包括采血管类型、及时处理和适当的血浆操作，这些对于确保ctDNA检测的分析有效性和可重复性至关重要。

正确的血液采集和处理程序可防止来自裂解血细胞的基因组DNA污染。美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国病理学家协会(CAP)联合建议，用于ctDNA检测的血液应收集在细胞稳定管中，这种管允许在室温下延迟处理数天而不会发生显著的白细胞裂解。当及时处理时，也可使用标准EDTA管，但血浆分离应在采血后6小时内完成。血浆（而非血清）是ctDNA检测的首选基质，因为血清制备过程中的凝血会从白细胞中释放基因组DNA，稀释肿瘤来源的DNA片段并降低分析灵敏度。

血液应从外周静脉采集，采血师应遵循采血管制造商的说明，通常10 mL血液可产生约4.7 mL血浆，这是为高灵敏度ctDNA检测获得足够cfDNA输入所需的最低推荐血浆量。采集后应立即将管轻轻颠倒8-10次，确保稳定剂与血液充分混合，避免剧烈摇晃，因为可能导致溶血。试管应在环境温度（18-25°C）下储存和运输，避免冷藏（<10°C）或高温（>37°C），因为极端温度会影响细胞稳定性和DNA保存。样本可在室温下使用保护性包装运输，避免物理应力（振动、撞击、冷冻或过热）。

采集后，必须在冷冻前将血浆与细胞成分分离，因为冷冻未离心的全血会降解ctDNA。到达实验室后，通常进行两步离心（例如1600 g 10分钟，然后16000 g 10分钟）以去除细胞碎片，然后将血浆在-80°C下冷冻。处理后的血浆应分装为单次使用的等分（例如1 mL小瓶），以避免多次冻融循环，这会降解核酸并降低ctDNA的可检测性。

来自白细胞的配对基因组DNA可从EDTA管或细胞稳定管的白细胞层中提取。虽然细胞稳定管旨在稳定血细胞并防止裂解，但白细胞在管中保持完整。

从血浆中提取游离DNA

离心柱法和磁珠法是cfDNA提取中最常用且经过验证的方法，离心柱法用于大多数已发表的研究。分子病理学协会和CAP建议选择经过cfDNA回收验证的方法，特别是对于临床检测。cfDNA片段大小反映其生物学起源：正常cfDNA主要来自凋亡造血细胞的约166 bp核小体相关片段，而肿瘤来源的cfDNA富含较短的片段（100-150 bp），这是由于癌细胞中染色质结构改变和核酸酶活性异常。这种大小差异有助于肿瘤检测，因为优先回收较短DNA片段的提取方法可相对富集ctDNA。这种富集通过增加可检测的肿瘤特异性变异数量和改善低频突变的识别，提高下游突变分析灵敏度。不同提取试剂盒在回收短片段与长片段cfDNA的效率上有所不同。对于需要高产短片段的应用（如突变分析），应选择有利于短片段回收的试剂盒。对于定量分析，应优先选择具有高可重复性和最小大小偏倚的方法。自动化提取平台可以减少手动操作时间并提高可重复性。提取后务必使用荧光分析和基于PCR的方法定量cfDNA产量并评估完整性，以确保适用于下游应用。

增加检测中的cfDNA输入量通常可提高ctDNA检测的灵敏度，因为更多的DNA分子可增加捕获罕见肿瘤衍生片段的概率。然而，一旦达到最佳输入水平（通常约30-50 ng cfDNA），这种获益会达到平台期。超过此范围，检测接近饱和，额外的cfDNA仅带来边际的分析灵敏度增益。因此，进一步增加cfDNA输入量（需要采集超过标准10-20 mL的血液体积）对检测性能的改善有限。这也反映了最大化分子输入与维持可行且微创采血方案之间的实际平衡。

对于数字PCR(ddPCR)突变分析，每个反应的最低推荐输入量通常为10-20 ng cfDNA，最佳输入量为20-50 ng。该范围允许可靠检测低频变异，平衡灵敏度和检测精度，也得到了技术验证研究和临床化学检测标准的支持。对于ddPCR，检测下限受限于存在的突变DNA拷贝数。验证研究表明，每个反应至少35-64个突变拷贝可实现可靠的定量。

对于靶向二代测序（NGS）法，如癌症个性化深度测序(CAPP-Seq)或分阶段测序(PhasED-seq)，最低cfDNA输入量通常为10 ng，根据检测验证方案，推荐输入量为30-50 ng每反应。对于高灵敏度应用（如微小残留病），优选更高的输入量（≥30 ng）以最大化分子复杂性和罕见事件的检测；灵敏度随输入量增加而提高，但实际的cfDNA产量常限制可达到的量。AMP和CAP建议报告NGS检测的cfDNA输入量，并反对直接使用未经定量的提取物。

ctDNA定性和定量的主要方法

图1. 游离DNA（cfDNA）测序方法中变异单元和错误抑制策略的概念性比较

示意图展示了随着变异定义越来越严格，分析敏感性逐步提升的过程：

• 基于单核苷酸变异（SNV）的方法（左侧）：利用UMI（Unique Molecular Identifier，唯一分子标识符）共识检测单个突变，敏感性约为 10⁻⁵（即每100,000个分子中可检测1个突变）。

• 双链共识变异（DCVs，中间）：要求DNA双链上均出现一致的突变（反式，in trans），将敏感性提升至约 10⁻⁶（即每1,000,000个分子中可检测1个突变）。

• 相位变异（PVs，右侧）：检测同一条DNA片段上的多个突变（顺式，in cis），敏感性可达接近 10⁻⁷（即每10,000,000个分子中可检测1个突变）。

用于淋巴瘤ctDNA定性和/或定量的主要方法是基于PCR和NGS的检测，包括数字PCR、Ig测序、带化学误差抑制的杂交捕获NGS、带数字误差抑制的杂交捕获NGS、分阶段测序以及全外显子组测序。

数字PCR

ddPCR对于单核苷酸变异、拷贝数改变和基因重排非常稳健，且受DNA质量的影响小于传统定量PCR，允许分析片段化或低输入样本。其局限性包括需要预先知道目标突变，以及与NGS方法相比多重检测能力较低。

Ig测序

免疫球蛋白(Ig)基因重排主要是Ig重链和轻链的V(D)J连接，通过Ig测序进行追踪，该方法依赖通用引物扩增和测序Ig重链和轻链基因，以识别淋巴瘤克隆型。需要高输入量的cfDNA和深度测序才能检测血浆中的稀有克隆型，通常需要50-100 ng ctDNA和超过10000倍每个靶标的unique覆盖度，以达到10⁻⁴的灵敏度。其优点包括高肿瘤特异性和在B细胞淋巴瘤中的广泛适用性。假阳性风险来自与肿瘤无关的背景B细胞克隆型，以及轻链克隆型的较低特异性，后者可能与正常B细胞群体重叠。此外，来自裂解的外周血单核细胞的技术假象和污染可能干扰结果。

在基线cfDNA中检测肿瘤克隆型的问题包括：治疗前ctDNA丰度低可能限制灵敏度；由于空间异质性或采样偏倚，组织中的优势肿瘤克隆型可能不在血浆中体现；以及在免疫球蛋白高度突变的淋巴瘤中检测肿瘤克隆型的问题，包括IG基因中的体细胞高频突变，可能破坏引物结合并导致假阴性或不完全的克隆型恢复。这在生发中心来源的淋巴瘤（如滤泡性淋巴瘤，其中高频突变广泛存在）中尤其具有挑战性。诊断性淋巴瘤活检的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本通常用于告知需要在cfDNA中追踪的肿瘤克隆型。FFPE样本通常产生片段化或化学修饰的DNA，降低克隆型识别和后续MRD追踪校准的效率和准确性，可能导致较低的校准率和肿瘤克隆型的漏检。

带化学误差抑制的杂交捕获NGS

杂交捕获NGS（例如CAPP-Seq）靶向淋巴瘤相关遗传畸变（单核苷酸变异、易位、拷贝数变化）的panel，它们通常包含30至475个基因。较大的panel旨在捕获各种淋巴瘤亚型中复发性和驱动性遗传改变的全谱。杂交捕获NGS整合了化学和计算误差抑制策略，以提高分析灵敏度和特异性。尽管误差过滤能够可靠地检测和过滤掉大部分假阳性（例如由测序假象，尤其是片段末端的假象、胞嘧啶脱氨、聚合酶错误、同聚物引起的技术假象、假基因和高GC含量区域导致错配读段，或平台特异性噪声引起），但几乎总是需要额外的优化。与细胞基因组DNA相比，cfDNA中胞嘧啶脱氨尤其增加，可能是由于长期暴露于血浆核酸酶和细胞外环境，导致替代错误率升高，特别是C:G>T:A转换，这些错误不仅限于片段末端，并且可以持续通过错误校正。

化学误差抑制采用唯一分子标识符或双链测序。UMI是在PCR扩增前连接到每个DNA片段上的短随机核苷酸标签。在分析过程中，共享相同UMI的读段被分组为“家族”，并为每个家族生成共有序列。这种共有方法消除了随机的PCR和测序错误，因为真正的变异预计会出现在一个家族内的多个读段中，而错误通常仅出现在单个读段中。增加家族大小（每个UMI的读段数）可进一步降低错误率。双链测序是一种分子误差抑制技术，其中每个原始双链DNA分子的两条链都独立地用UMI标记、测序，然后通过计算比较生成代表原始DNA模板的共有序列。在文库制备过程中，不同的UMI被连接到每个DNA片段的正向和反向链上。测序后，读段按UMI和链方向分组。只有在两条链的共有序列中都确认的变异才被视为真阳性，而不一致或单链的变异被过滤掉。在淋巴瘤中使用UMI进行准确ctDNA检测时，推荐的测序覆盖深度至少为每个靶区域10000倍unique、去重覆盖度，这通常转化为30000倍至100000倍或更高的原始测序深度，具体取决于检测设计和cfDNA输入量。这一深度确保有足够的读段家族（即由共享相同UMI的多个原始读段衍生的共有读段）来自信地检测低频变异并抑制技术错误。然而，增加测序深度会达到灵敏度饱和点。这种饱和是因为独特原始DNA片段的数量受cfDNA输入量限制（约每60 ng对应10,000个细胞当量），无论测序读段多少，去重深度都无法超过这一上限。超过此点后，进一步增加覆盖度不会改善检测限，此时检测限受限于测序化学和样本制备固有的背景错误率。

带数字误差抑制的杂交捕获NGS

数字误差抑制使用计算方法减少测序错误，而不需要物理分子条形码。这包括将具有相同比对起始和终止位置的读段分组为共有家族，假设共享精确基因组坐标的读段可能来自相同的原始分子，类似于使用UMI标记读段的分组方式，但使用位置而非条形码。此外，平台特异性错误抑制涉及减去预定义的“黑名单”，这些是已知在特定基因组背景或仪器工作流程中反复出现的测序假象。通过滤除这些重复的技术错误，该流程显著减少了假阳性变异调用，尤其是在极低变异等位基因频率下。总之，基于UMI的化学条形码和数字错误过滤创建了一个高度稳健的错误抑制系统，能够可靠地检测原本会被背景噪声掩盖的稀有ctDNA突变。

ctDNA检测可大致分为肿瘤不可知型（基于文库的固定panel，无需事先肿瘤测序即可检测复发突变）和肿瘤已知型（追踪从肿瘤组织中识别的患者特异性变异的个性化检测）。肿瘤不可知方法可实现快速部署且不需要肿瘤材料，使其在临床环境中广泛适用；然而，它们通常受限于较低的灵敏度（通常VAF ≥0.1%），并可能遗漏罕见或患者特异性变异。相比之下，肿瘤知情方法通过整合多个患者特异性突变的信号，实现了显著更高的灵敏度（VAF ~0.001-0.01%），这对于微小残留病检测尤为有利。这种增加的灵敏度以需要肿瘤组织进行检测设计、更长的周转时间和更高的成本为代价。结合两种方法元素的混合策略正在出现，以平衡灵敏度和实用性。使用杂交捕获NGS对治疗前ctDNA进行基因分型有两个主要目的：识别具有诊断、预后或治疗相关性的突变，以及建立患者特异性肿瘤突变panel，用于后续纵向cfDNA样本中肿瘤知情的MRD追踪。因此，这一初始基因分型步骤至关重要，尽管在ctDNA典型的低变异等位基因频率下尤其具有挑战性，并且不同变异调用器在灵敏度和特异性上存在显著差异。并行使用多个变异调用器提供了一种更保守的分析方法，减少了假阳性突变的风险，但增加了专家审查的需求。出于这些原因，手动检查候选体细胞变异仍然是当前基因分型工作流程中的关键步骤，目标是从肿瘤或基线测序数据中筛选出患者特异性突变谱。专家审核员通常使用Integrative Genomics Viewer审查每个变异，评估读段支持、链平衡、比对质量和局部比对背景。变异通常按标准化的5分量表评分，其中1分反映证据极少（例如，单个支持分子或明显的假象特征），5分代表具有强有力、高质量支持、完全符合真正体细胞事件的变异。为确保不同分析人员和实验室之间的一致性和可重复性，许多机构实施了用于体细胞变异手动审查和优化的正式标准操作程序。值得注意的是，对于MRD监测，在系列样本中可能同时追踪数百至数千个变异，单个变异水平的手动审查既不实用也不需要。相反，MRD检测采用自动化的聚合统计框架，整合所有监测位点的信号以生成复合检测调用，显著提高了可扩展性和可重复性。用于基因分型环境中自动化变异筛选的机器学习方法也在积极开发中，随着这些工具经过正式的临床验证，可能会进一步减少对手动审查的依赖。

分阶段测序

分阶段测序是指使用杂交捕获靶向二代测序检测和追踪ctDNA中同一DNA片段上物理位置接近的多个体细胞突变（分阶段变异）。在B细胞淋巴瘤中，这些分阶段变异是由于活化诱导的胞嘧啶脱氨酶(AID)介导的体细胞高频突变所致，导致在短基因组区域内形成突变簇。通过识别这些分阶段变异并对单个cfDNA分子上的这些变异一起测序，分阶段测序能够高度特异地追踪肿瘤来源的DNA片段。对于错误抑制，分阶段测序利用技术或生物测序错误独立地在单个DNA分子上产生相同模式的多个紧密间隔突变的极低概率（即，在单个读段或读段对中观察到）。这种同一分子上变异的共现实现了背景错误率的大幅降低，这与双链测序方法不同，后者依赖于原始DNA双链两条链上突变检测的一致性。

基于分阶段变异的检测可能受到生物背景来源的假阳性信号的影响。这些背景来源包括隐匿性惰性B细胞肿瘤、低计数单克隆B细胞淋巴细胞增多、意义未明的单克隆丙种球蛋白病，以及其他向循环中释放免疫球蛋白基因重排的过程。此外，AID介导的体细胞高频突变可能在正常B细胞（尤其是循环记忆B细胞）中异常地将分阶段变异引入癌基因。因此，超灵敏的ctDNA检测可能检测到这些背景分阶段变异，从而导致假阳性调用。

全外显子组测序

由于对全外显子组进行超深度测序的技术和灵敏度限制以及成本问题，在淋巴瘤中对ctDNA进行全外显子组测序的研究数量有限。

淋巴瘤ctDNA定性和定量检测的分析验证

CLSI指南EP17-A2用于定义检测特异性（或称空白限）和分析灵敏度（或称检测限）。LOB是从不含分析物的样本（空白样本）的一系列测量中预期观察到的最高值。为确定LOB，使用ctDNA检测测量多个重复（通常≥60个）的空白样本（例如，来自健康供体无可检测ctDNA的血浆）。然后使用公式LOB = 均值blank + 1.645 × SDblank计算LOB，其中均值blank是空白重复的平均值，SDblank是这些重复的标准差。因子1.645对应于正态分布的第95百分位数。LOD是可以与LOB可靠区分且以95%概率检测到的最低分析物浓度。为确定LOD，需要制备接近预期LOB的低水平ctDNA样本，并测量每个浓度的多个重复（≥60个）。LOD计算公式为LOD = LOB + 1.645 × SD低浓度样本，其中SD低浓度样本是低水平ctDNA样本测量的标准差。这种方法确保LOD同时反映了空白和低水平样本的变异性。这些程序直接适用于ctDNA检测，包括ddPCR和基于NGS的方法A。AMP和CAP建议使用这些标准化方法报告临床ctDNA检测验证的LOB和LOD。

领先的泛癌ctDNA平台的综合性多中心评估显示，在0.5%等位基因频率以上可实现可靠检测，具有高灵敏度和可重复性。低于此阈值时，检测变得不太可靠，尤其是当输入DNA有限时，这凸显了LOD对临床决策的重要性。按照CLSI指南验证的ddPCR检测报告LOB为4个突变拷贝，LOD为12-22个拷贝，并能检测极低等位基因频率（低至0.00125-0.005%）的ctDNA突变。在专门为淋巴瘤设计的ctDNA平台中，杂交捕获NGS检测（例如CAPP-Seq）的LOD通常在0.002-0.01%等位基因频率（20-100 ctDNA颗粒/百万cfDNA颗粒或ppm）范围内，取决于输入DNA量和错误抑制方法。基于PCR的检测和Ig克隆型测序方法具有更高的LOD，通常为0.01-0.1%等位基因频率（100-1000 ppm）。对于PhasED-Seq检测，LOB定义为背景错误率1.95×10⁻⁸（即0.00000195%）和在空白血浆样本中0.24%的假阳性率。在标准化分析条件下使用120 ng输入DNA时，LOD为0.7 ppm，相当于0.00007%的变异等位基因频率。然而在临床实践中，可达到的LOD因患者而异，取决于从个体肿瘤中识别的可追踪分阶段变异数量以及可用的cfDNA输入量。最近的前瞻性数据显示，不同患者之间的LOD95可能相差两个数量级以上，这凸显了在每次检测结果中报告患者特异性LOD对于准确解释阴性MRD结果的重要性。量化淋巴瘤ctDNA-MRD的研究的关键方面总结于表2-6（表格过多就不放上来了，详见原文）。

ctDNA的临床应用

尽管基于ctDNA的突变谱不能替代基于组织检查的病理诊断（后者仍是金标准），但非侵入性分子检测在选定的临床背景下可作为有价值的补充工具。当活检材料不足以进行分子谱分析或病变在解剖学上难以到达时，这一点尤其相关。例子包括原发性中枢神经系统淋巴瘤，其中脑脊液ctDNA检测MYD88 L265P可在立体定向活检风险高时支持诊断；以及玻璃体视网膜淋巴瘤，当细胞学不确定时，房水或玻璃体液cfDNA测序可辅助诊断。在系统性淋巴瘤中，当组织耗尽或无法用于基因组分析时，液体活检可识别有临床意义的突变。

某些淋巴瘤亚型体现了这些挑战。血管内大B细胞淋巴瘤常表现为非特异性全身症状且缺乏离散的肿瘤肿块，使活检困难或无诊断性；而在原发性中枢神经系统淋巴瘤中，病变位于中枢神经系统内，立体定向活检存在操作风险或禁忌。在这两种情况下，在血浆或脑脊液来源的cfDNA中检测MYD88 L265P突变可提供有价值的诊断线索并指导早期临床决策。

除IVLBCL和PCNSL外，还有几种其他临床情况可能受益于基于ctDNA的基因分型，需要进一步研究，包括：在深部或手术难以到达的解剖部位怀疑复发时，重复活检风险高或不切实际（例如因合并症而体力状态差的患者）；坏死成分高或细胞密度低的肿瘤，传统活检常产生不足的DNA用于测序；不一致或模棱两可的组织病理学发现，ctDNA突变特征可能支持或完善初步诊断。目前的指南和医学文献共识不支持将ctDNA作为转化的独立诊断工具，因为缺乏经过验证的转化分子特征；确认高级别转化仍需要组织病理学。

将PET与ctDNA-MRD检测整合是一种合乎逻辑的方法。PET通常需要至少7-8 mm直径的宏观病变才能可靠检测，且无法检测到微观残留病。PET在特异性方面也有局限性，淋巴瘤治疗后约30%的¹⁸F-氟脱氧葡萄糖高摄取病变活检结果为假阳性，可能是由于治疗诱导的炎症变化。越来越多的证据一致支持治疗结束时ctDNA-MRD作为LBCL的预后标志物。最近三项使用基于PV的ctDNA-MRD技术的大型前瞻性研究，共涵盖超过425例患者，已证明EOT ctDNA-MRD状态是PFS和OS的强独立预后因素，优于传统的基于PET的反应评估。这些发现，连同早期使用不同ctDNA方法的研究，提供了强有力的证据。

NCCN B细胞淋巴瘤肿瘤学临床实践指南（2025年第2版）已更新，纳入对在完成一线治疗后PET显示部分代谢反应（即残留¹⁸F-氟脱氧葡萄糖摄取，Deauville评分4或5，但与基线相比摄取减少）的DLBCL患者进行ctDNA-MRD评估。指南建议在活检不可行时，将ctDNA-MRD评估作为评估阳性PET发现的替代方法，但有特定限制。部分代谢反应但ctDNA-MRD检测结果阴性的患者，可以遵循完全代谢反应路径进行影像学和临床随访（2B类推荐）。

待解决的问题与下一步方向

直到最近，淋巴瘤中ctDNA-MRD的评估仅限于几百名高度筛选的患者，在更广泛、未经选择的人群中严重缺乏前瞻性数据。然而最近三项大型前瞻性研究大幅扩展了证据基础，总共涵盖超过425例具有EOT ctDNA-MRD数据的患者。这些研究表明，在多中心网络中系统性的前瞻性样本收集实现了高可行性：在涵盖超过50个中心的HOVON-902真实世界队列中，使用肿瘤组织或治疗前血浆，分阶段变异的识别成功率为99%，且无论基线样本来源如何，ctDNA-MRD均具有预后意义。同样，DIRECT研究展示了在多个中心使用独立开发的开源检测方法的可行性。这些发现表明，早期研究中影响约半数患者的样本缺失和不合资格患者的实际问题，可以通过标准化的前瞻性收集程序得到显著缓解。尽管如此，关于在常规临床实践中最佳实施ctDNA-MRD仍存在重要问题，包括阳性MRD结果的临床可操作性、需要系列监测还是单时间点评估，以及极低水平残留ctDNA的意义。

核心针穿刺活检的使用增加（在某些机构达到60-80%）加剧了这一问题。核心针活检通常在日常诊断检查中被完全消耗，没有留下可用于MRD标志物发现的组织。另一种策略是从治疗前血浆样本中衍生MRD标志物。这种方法还有一个额外的好处，即确认肿瘤以可检测水平向血流中释放ctDNA，但它需要从所有新诊断的DLBCL患者中预先收集和储存足够的血浆体积，这将需要对生物样本库基础设施进行大量投资。

此外，ctDNA-MRD检测在真实世界环境中在临床相关时间范围内提供结果的能力，尚未得到证实。周转时间因方法而异：ddPCR可在1-3天内提供结果；杂交捕获NGS（例如CAPP-Seq、PhasED-seq）通常需要7-14天，取决于测序和生物信息学处理，SAKK39/19试验中显示9天周转；Ig-NGS平台由于集中实验室处理和批量要求，通常需要2-3周。尽管商业提供商（如clonoSEQ®、LymphoVista、CLARITY™和KAPA HyperCap DS NHL Panel）正在进入该领域，并且一些学术实验室已开发出经认证的内部检测，但对ctDNA-MRD的获取仍然有限。正在进行的标准化和协调检测的努力，例如由EuroClonality网络领导的努力，对于建立更广泛的实验室网络至关重要，这目前是患者获取的主要瓶颈。

几项正在进行的临床试验预计将产生关于ctDNA-MRD在大B细胞淋巴瘤中可行性和诊断性能的更高质量和更广泛的证据（例如，NCT06693830、NCT06828991、NCT06902012、NCT06594939、NCT05675982、NCT04604067、NCT04980222、NCT03758989）。

参考文献

Blood Adv . 2026 Jun 12:bloodadvances.2024015609. doi: 10.1182/bloodadvances.2024015609.

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