深度解析医学证据，DeepEvidence为你支撑决策
摘要:目的探讨细胞外囊泡(EV)表面高迁移率族蛋白B1(EV-HMGB1)与行颈动脉支架置入术颈动脉粥样硬化性狭窄(CAS)患者斑块易损性的关系｡方法前瞻性连续纳入2023年2月至2024年10月于首都医科大学宣武医院神经外科行颈动脉支架置入术的CAS患者｡收集患者的临床资料,包括年龄､性别､体质量指数､既往史(高血压病､糖尿病､高脂血症､冠心病､心房颤动､外周血管病)､吸烟史､饮酒史､是否为症状性(症状性定义为入院前6个月内曾出现同侧眼部或脑缺血症状,伴或不伴前循环区域梗死;无症状定义为入院前6个月内未发生与同侧颈动脉区域相关的眼部或脑缺血症状)CAS､入院时用药情况(抗血小板聚集药物､他汀类药物､降压药物)､入院时实验室检查指标(总胆固醇､高密度脂蛋白胆固醇､低密度脂蛋白胆固醇､三酰甘油､空腹血糖)｡所有患者于术前行颈部CT血管成像(CTA)和三维时间飞跃法MR血管成像(3D TOF-MRA)以评估颈动脉狭窄侧别､患侧颈动脉狭窄率､对侧颈动脉狭窄率(≤50%､>50%)及患侧颈动脉斑块是否为易损斑块｡斑块易损性依据颈动脉斑块报告和数据系统(plaque-RADS)进行分类,plaque-RADS分级分为1~4级,其中斑块plaque-RADS分级3a~3c级患者为稳定斑块组,斑块4a~4c级患者为易损斑块组,并将易损斑块组进一步分为4a､4b､4c级亚组｡通过透射电子显微镜观察患者血浆中EV形态,采用纳米颗粒追踪分析技术测定EV的粒径分布与浓度;通过蛋白质免疫印迹法检测EV典型阳性标志物肿瘤易感基因101(TSG101)､白细胞分化抗原(CD)9､CD81及EV阴性标志物钙网蛋白的表达,并使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞裂解液作为阳性对照,用于鉴定所提取EV的典型表征｡采用酶联免疫吸附试验检测血浆EV-HMGB1水平,并对EV样本和HUVEC进行蛋白质免疫印迹分析｡将两组比较差异有统计学意义的因素纳入多因素Logistic回归分析,探讨EV-HMGB1是否为行颈动脉支架置入术CAS患者发生易损斑块的影响因素｡采用受试者工作特征(ROC)曲线评估EV-HMGB1对行颈动脉支架置入术CAS患者发生易损斑块的预测效能｡结果共纳入行颈动脉支架置入术CAS患者311例,男258例,女53例,平均(67±7)岁,其中稳定斑块组201例,易损斑块组110例｡易损斑块组患者中,plaque-RADS分级4a级57例,4b级47例,4c级6例｡(1)与稳定斑块组相比,易损斑块组男性患者比例更高[92.7%(102/110)比77.6%(156/201), P=0.001],余临床及影像学资料的组间差异均无统计学意义(均P>0.05)｡(2)稳定斑块组与4a级､4b级和4c级斑块患者的男性[分别为77.6%(156/201)､98.2%(56/57)､ 89.4%(42/47)､4/6,P<0.01]和外周血管病[分别为1.5%(3/201)､8.8%(5/57)､2.1%(1/47)､0/6, P= 0.047] 比例差异均有统计学意义,余临床及影像学资料4组间差异均无统计学意义(均P>0.05);事后两两比较结果显示,4a级斑块患者的男性比例高于稳定斑块组[98.2%(56/57)比77.6%(156/201),校正后P=0.0004],外周血管病患者比例的两两组间比较差异均无统计学意义(校正后均P>0.05)｡(3)透射电子显微镜观察结果显示,稳定斑块组与易损斑块组患者血浆中均可见典型杯状囊泡结构,囊泡膜完整或部分包裹高密度物质,两组间未观察到明显形态学差异;纳米颗粒追踪分析结果显示,易损斑块组与稳定斑块组的EV粒径[(139.1±60.6)nm比(131.4±50.4)nm, P=0.23]､EV浓度[(3.01±1.24)×109颗粒/ml比(2.87±1.09)×109颗粒/ml, P=0.31]差异均无统计学意义;蛋白质免疫印迹检测显示,与HUVEC细胞裂解液阳性对照组相比,稳定斑块组与易损斑块组患者血浆中的EV标志物TSG101､CD9和CD81均表达阳性,两组均未检出EV阴性标志物钙网蛋白｡(4)易损斑块组患者血浆EV-HMGB1浓度高于稳定斑块组[6.11(4.66,7.33)μg/L比4.06(3.49, 4.78)μg/L,P<0.01]｡EV-HMGB1浓度在4组间差异有统计学意义(H=96.34,P<0.01),事后两两比较结果显示,稳定斑块组EV-HMGB1浓度[4.06(3.49,4.78)μg/L]低于4a级[5.68(4.25,6.66)μg/L,校正后P<0.01]､4b级[6.37(5.19,7.62)μg/L,校正后P<0.01]和4c级[5.87(5.38,7.19)μg/L,校正后P=0.0029]亚组｡而4a､4b､4c级3个亚组间两两比较的EV-HMGB1浓度差异均无统计学意义(校正后均P>0.05)｡(5)多因素Logistic回归分析结果显示,男性(OR=3.39,95%CI:1.36~9.74,P=0.014)和高EV-HMGB1浓度(OR=3.68,95% CI:2.76~5.12,P<0.01)为行颈动脉支架置入术CAS患者发生易损斑块的独立危险因素｡(6)ROC曲线分析显示,血浆EV-HMGB1识别CAS患者易损斑块的曲线下面积为0.831(95%CI:0.779~0.883, P<0.01),最佳截断值为5.344μg/L,敏感度为65.5%,特异度为95.5%｡结论血浆EV-HMGB1水平与行颈动脉支架置入术CAS患者斑块易损性相关,或可作为识别其易损性的潜在生物标志物｡
缺血性卒中是全球范围内致死和致残的主要原因之一,其中18%~25%与颈动脉粥样硬化性狭窄(carotid atherosclerotic stenosis, CAS)相关[1-2]｡传统观点认为管腔狭窄程度是评估CAS相关卒中风险的主要依据[3]｡然而,近年研究表明,斑块易损性为评估缺血性卒中发生风险更重要的因素[4-6]｡尽管目前影像学技术可相对精准地评估易损斑块的形态学特征,但其在常规筛查中的应用仍存在限制｡因此,寻找可及性更高､操作更简便的替代指标具有一定临床意义,其中从外周血样本中筛选与斑块易损性相关的生物标志物,已成为个体化评估CAS患者卒中发生风险的重要研究方向｡
细胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)可携带生物活性物质介导细胞间通信,具有通过调控免疫应答､炎症级联反应及新生血管生成等过程促进易损斑块形成的特性,是极具潜力的颈动脉易损斑块生物标志物[7-10]｡促炎细胞因子介导的炎症微环境作为导致斑块易损的主要原因之一,在斑块形成过程中发挥着重要作用[11-12]｡高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1, HMGB1)为促炎因子之一,在动脉粥样硬化斑块形成和进展过程中均发挥重要作用[13-14]｡此外,已有研究显示,EV来源的HMGB1可作用于血管内皮细胞､巨噬细胞等特异靶标,介导或放大局部炎症反应[15-16]｡本研究团队前期的研究结果显示,HMGB1在血浆EV表面高度富集,且可介导血管内皮炎症和损伤[15]｡然而,血浆EV表面HMGB1(EV-HMGB1)与斑块易损性之间是否存在关联尚缺乏直接的临床证据｡因此,本研究拟分析EV-HMGB1与行颈动脉支架置入术CAS患者颈动脉斑块易损性之间的相关性,探讨其作为易损斑块生物标志物的潜力｡
1 对象与方法
1.1 对象
前瞻性连续纳入2023年2月至2024年10月于首都医科大学宣武医院神经外科行颈动脉支架置入术的CAS患者｡本研究遵循《赫尔辛基宣言》,研究方案经首都医科大学宣武医院医学伦理委员会审核批准(伦理审批号:临研审[2021]124号)｡所有参与者均签署了研究知情同意书｡
纳入标准:(1)年龄≥18岁;(2)CAS患者符合以下适应证行颈动脉支架置入术[17]:入院前6个月内发生狭窄同侧的短暂性脑缺血发作或缺血性卒中,且影像学检查证实颈动脉狭窄率≥50%;虽无明显临床症状,但影像学证实颈动脉狭窄率≥70%,且综合评估后认为需行血运重建;存在颈动脉内膜切除术高危因素(如严重心肺疾病､对侧颈动脉闭塞等)的CAS｡
排除标准:(1)临床､实验室或影像学资料不完整;(2)用于EV-HMGB1水平检测的血浆样本缺失;(3)患有严重心､肝或肾脏疾病;(4)患有恶性肿瘤;(5)目标颈动脉闭塞｡
1.2 资料收集
收集患者的临床资料,包括年龄､性别､体质量指数(body mass index, BMI)､既往史(高血压病[18]､糖尿病[19]､高脂血症[20]､冠心病[21]､心房颤动[22]､外周血管病[23])､吸烟史[24]､饮酒史[24],是否为症状性(症状性定义为入院前6个月内曾出现同侧眼部或脑缺血症状,伴或不伴前循环区域梗死;无症状定义为入院前6个月内未发生与同侧颈动脉区域相关的眼部或脑缺血症状[25])CAS､入院时用药情况(抗血小板聚集药物､他汀类药物､降压药物)､入院时实验室检查指标(总胆固醇､高密度脂蛋白胆固醇､低密度脂蛋白胆固醇､三酰甘油､空腹血糖)｡
1.3 颈动脉斑块性质评估
所有患者于术前行颈部CT血管成像(CTA)和三维时间飞跃法MR血管成像(three-dimensional time-of-flight MR angiography, 3D TOF-MRA)以评估颈动脉狭窄侧别､患侧颈动脉狭窄率､对侧颈动脉狭窄率(>50%､≤50%)及患侧颈动脉斑块是否为易损斑块｡颈动脉狭窄率基于北美症状性颈动脉内膜切除试验(North American symptomatic carotid endarterectomy trial, NASCET)标准进行评估[26]｡
斑块易损性依据颈动脉斑块报告和数据系统(plaque-reporting and data system, plaque-RADS)进行分级[27-29]｡plaque-RADS分级分为1~4级,1级为正常血管壁;2级为血管壁最大厚度<3mm且无复杂斑块特征;3级可细分为3a､3b､3c级,其中3a级与3b级均为血管壁最大厚度>3mm且伴有脂质坏死核心的斑块,具有厚且完整的纤维帽为3a级,具有薄纤维帽为3b级,3c级为愈合的溃疡斑块(不受血管壁厚度限制);4级斑块具有复杂斑块特征,不论血管壁厚度,存在斑块内出血为4a级,存在纤维帽破裂为4b级,存在管腔内血栓为4c级｡本研究将plaque-RADS分级3a~3c级斑块定义为稳定斑块,4a~4c级斑块定义为易损斑块,并将所有患者分为稳定斑块组和易损斑块组｡所有3D TOF-MRA和CTA图像均由2名工作年限>5年的放射科医师在不知晓任何临床信息的情况下独立完成评估｡若二者评估结果不一致,则由第3名工作年限>15年的放射科医师做出最终裁定｡将2名放射科医师对患者颈动脉斑块性质的判定结果进行一致性检验,其中Kappa值0.81~1.00为一致性程度很强,0.61~0.80为一致性程度较强,0.41~0.60为一致性程度中等,0.21~0.40为一致性程度一般,≤0.20为一致性较差[30]｡
1.4 血浆EV的提取与鉴定
入院当日使用乙二胺四乙酸抗凝采血管收集5ml患者外周静脉血,4℃ 2000×g离心20min,收集上层血浆以备后续EV提取｡取1ml血浆,用0.22μm的滤网过滤,使用Exosupur柱[31-33](北京恩泽康泰生物科技有限公司,批号:ES9P14e)进行EV提取｡实验操作严格遵循制造商说明书执行,收集前5个富含高纯度(回收率和分离纯度分别为99.44%和94.87%)EV的馏分用于EV-HMGB1检测｡根据国际胞外囊泡学会发布的细胞外囊泡研究的最基本信息(minimal information for studies of extracellular vesicles, MISEV)2023指南[8],通过以下3个方面鉴定所提取的EV:(1)通过透射电子显微镜(日立公司,日本)观察EV形态,EV经3%戊二醛固定过夜后,取5μl样品滴加至聚乙烯醇缩甲醛-碳复合支持膜载样铜网上,静置1min,用滤纸吸除多余液体;随后以2%乙酸铀酰染色2min,于透射电子显微镜下观察并成像;(2)采用纳米颗粒追踪分析技术,使用NanoSight NS300系统(马尔文帕纳科公司,英国)测定EV的粒径分布与浓度;(3)通过蛋白质免疫印迹法检测EV典型阳性标志物肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101, TSG101)､白细胞分化抗原(cluster of differentiation, CD)9､CD81及EV阴性标志物钙网蛋白的表达,并使用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC;武汉尚恩生物公司,批号:SNL-503)的细胞裂解液作为阳性对照,用于鉴定所提取EV的典型表征｡
1.5 EV-HMGB1水平测定
取收集的高纯度EV悬液,用磷酸盐缓冲液按1∶9的体积比稀释后,每孔加入100μl稀释液,采用人HMGB1酶联免疫吸附试验试剂盒(武汉Elabscience生物科技股份有限公司,批号:E-EL-H1554)定量检测循环血液中EV-HMGB1的浓度,实验操作严格遵循制造商说明书执行;使用Tecan Infinite 200Pro酶标仪(Tecan公司,瑞士)测定450nm波长下各反应孔的吸光度值;通过试剂盒标准品生成的标准曲线计算EV-HMGB1浓度｡
1.6 蛋白质免疫印迹分析
向EV样本和HUVEC加入放射免疫沉淀分析(radio-immunoprecipitation assay, RIPA)裂解液(中国索莱宝公司,批号:R0010)进行裂解并提取总蛋白｡采用BCA蛋白分析试剂盒(赛默飞世尔科技公司,美国;批号:23225)对蛋白质进行定量分析,然后取等量总蛋白通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,并转印至0.45μm聚偏二氟乙烯膜(默克公司,德国;批号:IPVH00010)｡随后,采用5%脱脂牛奶封闭膜1.5h,并于4℃条件下与以下一抗孵育过夜:CD9抗体(Abcam公司,英国;批号:ab236630)､CD81抗体(Abcam公司,英国;批号:ab109201)､TSG101抗体(Abcam公司,英国;批号:ab125011)､钙网蛋白抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,批号:10427-2-AP)及GAPDH抗体(Abcam公司,英国;批号:ab8245)｡清洗后,将膜与相应种属的辣根过氧化物酶标记二抗(CST公司,美国;批号:7074P2､7076P2)在室温下孵育1h;充分清洗后,使用增强化学发光检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司,美国;批号:32209)和Bio-Rad凝胶成像系统(伯乐生命医学产品有限公司,美国)进行发光显影和拍照｡
1.7 统计学分析
使用SPSS27.0软件进行统计学分析｡采用Shapiro-Wilk检验对计量资料进行正态性检验,符合正态分布的计量资料以x-±s表示,组间比较采用两独立样本t检验;不符合正态分布的计量资料以中位数和四分位数[M(P25,P75)]表示,两组间比较采用Mann-Whitney U检验,多组间比较采用Kruskal-WallisH检验,当总体检验差异有统计学意义(P<0.05)时,采用Dunn’s法进行事后两两比较,并对P值进行Bonferroni校正｡计数资料以例(%)表示,将组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法,若多组间比较总体差异有统计学意义,则采用Fisher确切概率法并经Bonferroni校正进行事后两两比较｡将两组间比较差异有统计学意义的因素纳入多因素Logistic回归分析,探讨EV-HMGB1是否为行颈动脉支架置入术CAS患者发生易损斑块的影响因素｡采用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线评估EV-HMGB1对行颈动脉支架置入术CAS患者发生易损斑块的预测效能｡所有统计学检验均采用双侧检验,以P<0.05为差异有统计学意义｡
2 结果
共纳入行颈动脉支架置入术CAS患者311例,男258例,女53例,平均(67±7)岁,其中稳定斑块组201例,易损斑块组110例｡易损斑块组患者中,4a级57例,4b级47例,4c级6例｡
2.1 一致性检验
两名放射科医师对311例CAS患者颈动脉斑块性质的评估一致性程度很强,Kappa值为0.85(95% CI:0.787~0.913,P< 0.01)｡ 见表1｡
2.2 临床及影像学资料比较
与稳定斑块组相比,易损斑块组男性患者占比更高(P=0.001),余临床及影像学资料的组间差异均无统计学意义(均P>0.05)｡见表2｡
2.3 亚组分析
稳定斑块组患者与4a级､4b级和4c级斑块患者的男性(P<0.01)和外周血管病(P=0.047)患者比例的差异均有统计学意义,余临床及影像学资料4组间差异均无统计学意义(均P>0.05)｡事后两两比较结果显示,4a级斑块患者的男性比例高于稳定斑块组(校正后P=0.0004),外周血管病患者比例的两两组间比较差异均无统计学意义(校正后均P>0.05)｡见表3｡
2.4 EV的鉴定
透射电子显微镜观察结果显示,稳定斑块组与易损斑块组中均可见典型杯状囊泡结构,囊泡膜完整或部分包裹高密度物质,两组间未观察到明显形态学差异｡见图1a,1b｡
蛋白质免疫印迹检测显示,与HUVEC细胞裂解液阳性对照组相比,稳定斑块组与易损斑块组CAS患者的EV标志物TSG101､CD9和CD81均表达阳性,两组均未检出EV阴性标志物钙网蛋白｡见图1c｡
纳米颗粒追踪分析结果显示,易损斑块组与稳定斑块组的EV粒径[(139.1±60.6)nm比(131.4±50.4)nm, P=0.23]､EV浓度[(3.01±1.24)×109颗粒/ml比(2.87±1.09)×109颗粒/ml, P=0.31]差异均无统计学意义｡见图1d~1f｡
2.5 EV-HMGB1水平比较
易损斑块组患者血浆EV-HMGB1浓度高于稳定斑块组[6.11(4.66,7.33)μg/L比4.06(3.49,4.78)μg/L],组间差异有统计学意义(P<0.01)｡见图2a｡
EV-HMGB1浓度在4组间差异有统计学意义(H=96.34,P<0.01),事后两两比较结果显示,稳定斑块组EV-HMGB1浓度[4.06(3.49,4.78)μg/L]低于4a级[5.68(4.25,6.66)μg/L,校正后P<0.01]､4b级[6.37(5.19,7.62)μg/L,校正后P<0.01]和4c级[5.87(5.38,7.19)μg/L,校正后P=0.0029]亚组｡而4a､4b､4c级3个亚组间两两比较的EV-HMGB1浓度差异均无统计学意义(校正后均P>0.05)｡见图2b｡
2.6 影响CAS患者斑块易损性的多因素Logistic回归分析
多因素Logistic回归分析结果显示,男性(OR=3.39,95%CI:1.36~9.74,P=0.014)和高EV-HMGB1浓度(OR=3.68,95%CI: 2.76~5.12,P<0.01)为CAS患者发生易损斑块的独立危险因素｡见表4｡
2.7 ROC曲线分析
ROC曲线分析显示,血浆EV-HMGB1识别行颈动脉支架置入术CAS患者易损斑块的曲线下面积为0.831(95%CI:0.779 ~ 0.883,P<0.01),最佳截断值为5.344μg/L, 敏感度为65.5%,特异度为95.5%｡见图3｡
3 讨论
近年来,斑块易损性已成为评估CAS患者卒中风险的重要指标[6,27]｡颈动脉斑块的易损性与多种因素相关,其中炎症反应是其发生､进展与易损化的驱动力[12,34]｡既往研究显示,EV-HMGB1对特定靶细胞具有促炎作用[16,35-36],本研究进一步基于行颈动脉支架置入术CAS患者术前的血浆样本分析了EV-HMGB1与易损斑块的相关性,结果显示,高EV-HMGB1浓度是行颈动脉支架置入术CAS患者发生易损斑块的独立危险因素｡此外,血浆EV-HMGB1仅需常规外周血样本即可快速定量,操作标准化且可重复｡本研究ROC曲线分析结果显示,EV-HMGB1识别行颈动脉支架置入术CAS患者易损斑块的曲线下面积为0.831(95%CI:0.779~0.883),敏感度为65.5%,特异度为95.5%,具备良好的预测效能,或可作为评估CAS患者斑块易损性的生物标志物｡
HMGB1为典型的损伤分子相关模式,是动脉粥样硬化形成和进展过程中的关键调控因子[14,37]｡在斑块组织中,多种细胞类型如单核细胞､血管平滑肌细胞和内皮细胞等均可释放HMGB1,释放至胞外的HMGB1可通过多种机制放大局部炎症反应从而加速动脉粥样硬化进展[38-40]｡Tan等[38]研究显示,在慢性间歇性缺氧环境下,单核细胞和内皮细胞上调并释放HMGB1,进而诱导内皮细胞凋亡并促进巨噬细胞源性泡沫细胞形成,最终加速动脉粥样硬化进展｡泡沫细胞形成后进一步释放多种促炎细胞因子,从而放大炎症反应,加剧斑块不稳定性[41]｡此外,HMGB1还可通过与晚期糖基化终末产物受体结合刺激白细胞介素6和C-反应蛋白产生[42],这两种分子作为系统性炎症标志物,其水平升高与斑块易损性密切相关[43-44]｡兔髂动脉模型实验表明,外源性给予HMGB1可加速动脉粥样硬化进展[45]｡上述研究结果提示,经典促炎介质HMGB1可通过介导巨噬细胞驱动的炎症反应及局部免疫应答等机制驱动易损斑块的形成和进展｡而高水平EV-HMGB1为易损斑块独立危险因素这一临床观察结果,可能为HMGB1介导的免疫炎症轴在体激活的生物学外化｡
EV为细胞间通信的关键载体,不仅可通过其表面特异性配体将生物活性物质靶向递送至特定细胞,其脂质双分子层结构还可有效保护内容物免于降解,这种靶向与保护作用可使信号分子精准､稳定地投送至病变部位,从而有效介导病理信号传递[46-47]｡本研究团队前期研究结果显示,创伤性脑损伤患者来源的血浆EV-HMGB1可诱导脑血管内皮功能障碍,提示EV-HMGB1可能为HMGB1发挥促内皮损伤功能的关键活性形式[15]｡由于血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化进展的重要病理基础[48],因此EV-HMGB1介导的内皮损伤效应可能在颈动脉斑块失稳中发挥重要作用｡此外,Biscetti等[49]的研究对347例行颈动脉内膜切除术的糖尿病合并CAS患者术后斑块进行组织学分类,并采用酶联免疫吸附试验检测血清HMGB1水平,结果显示,易损斑块组(159例)血清HMGB1水平高于稳定斑块组[188例;(8.19±11.34)μg/L比(4.35 ± 6.49)μg/L,P<0.01],多因素Logistic回归分析显示,HMGB1是行颈动脉内膜切除术的糖尿病合并CAS患者发生易损斑块的独立危险因素(OR=19.60,95%CI: 4.75~27.39,P=0.015),为HMGB1与斑块易损性的关联研究提供了初步临床证据｡鉴于EV在HMGB1信号传递中的重要作用,本研究进一步在CAS患者中揭示了血浆EV-HMGB1水平与颈动脉易损斑块的独立相关性,且明确了血浆EV-HMGB1在斑块易损性评估中的重要价值｡
此外,本研究结果显示,男性为行颈动脉支架置入术CAS患者发生易损斑块的独立危险因素｡这与vanDam-Nolen等[50]研究结果一致,该研究纳入224例症状性轻中度颈动脉狭窄(狭窄率<70%)患者,结果显示,与女性(68例)比较,男性(156例)斑块内出血[49%(76/156)比16%(11/68);OR=2.8,95% CI:1.3~6.3,P< 0.01]和富含脂质的坏死核心[73%(114/156)比41%(28/68);OR=2.4,95% CI:1.2~4.7,P<0.01]发生率均更高,且这一差异独立于总体斑块体积,提示男性症状性轻中度颈动脉狭窄患者更易出现易损斑块,可能与男性体内缺少雌激素对心血管系统的保护作用有关｡雌激素不仅可改善血脂,还可直接作用于血管壁,抑制炎症反应[51]｡
综上所述,血浆EV-HMGB1水平与行颈动脉支架置入术CAS患者发生易损斑块独立相关,或可作为斑块易损性早期评估的候选生物标志物,辅助CAS患者的临床诊疗决策｡本研究存在一定的局限性:(1)单中心研究设计可能削弱统计效能,后续还需在更大规模的前瞻性､多中心队列中进一步验证本研究结论的可靠性与外推性;(2)本研究中斑块易损性分类依赖于影像学评估,尽管使用了plaque-RADS分级,但影像学固有的局限性可能为斑块性质分类带来潜在偏倚;(3)本研究所收集样本中女性比例较小,研究结果的确切临床意义需要在更大的队列中进一步验证｡