深度解析医学证据，lxfs.net为你支撑决策

生物系统的功能高度依赖细胞在组织中的空间位置。近年来，空间转录组学的发展使得研究人员能以单细胞分辨率解析组织结构和基因表达模式，为研究复杂的组织生态系统（如肿瘤微环境）提供了前所未有的机遇。但如何系统地将基因表达与其对空间表型的功能效应以及驱动这些过程的调控通路联系起来，仍是空间生物学领域的一大技术空白。

基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术结合单细胞RNA测序（如Perturb-seq）已能高效地将基因扰动与细胞表型及转录组变化相关联，而将其与空间转录组学融合是解析空间表型调控基因的新兴方向。目前，已有研究通过空间蛋白组成像或基于成像的sgRNA检测进行了初步探索，但缺乏全转录组层面的高通量解决方案。

近日，北京大学曾泽贤团队与清华大学潘登、华大生命科学研究院冯驭团队合作，开发了高通量空间CRISPR筛选测序技术SPAC-seq及配套空间扰动统计分析工具包TARDIS。SPAC-seq能够在保留组织空间位置信息的前提下，同时捕获CRISPR扰动对应的sgRNA序列和全转录组表达谱；TARDIS工具包可对空间扰动数据进行目标优先级排序、空间富集分析和下游信号通路挖掘。依托这套一体化技术体系，研究团队取得了多项关键发现：揭示了肿瘤细胞Icam1基因缺失经由免疫抑制与巨噬细胞极化驱动肿瘤侵袭转移，阐明了CD8⁺T细胞Cd44依靠和巨噬细胞Spp1互作调控空间表型，并展示了转录因子-趋化因子受体轴耦合细胞状态与趋化性的新型调控模型。总之，SPAC-seq和TARDIS为研究空间分辨的功能基因组学以及在不同生物学和疾病背景下的相关通路提供了一个全新的技术框架。

文章发表在Cell

SPAC-seq依托自主构建的逆转录病毒质粒系统SPACseq，将sgRNA嵌入GFP编码mRNA实现共转录，规避外源条形码设计缺陷，可适配 Visium HD、Stereo-seq等单细胞空间转录组平台进而原位捕获sgRNA及mRNA信息，然后通过二代测序将基因扰动与空间表型关联。体外对比经典CROP-seq系统，SPACseq在小鼠原代细胞中展现出更高的转导效率，其mRNA中嵌合sgRNA的表达量提高约9.08倍，且其基于mRNA的sgRNA检测与金标准基因组DNA测序结果高度相关，显著优于CROP-seq；平均基因敲除效率也达到75.19%。

在MC38小鼠皮下肿瘤模型中，研究团队完成体内大规模筛选，SPAC-seq成功回收了超90%的sgRNA，并在连续切片中展现出高度空间可重复性，约35%的细胞bin和44%的单细胞被分配了唯一明确的sgRNA。利用该平台，研究团队还验证了已知MHC通路基因以及新靶点B4galt1的功能。此外，SPAC-seq兼容直接捕获与mRNA嵌入捕获两种策略，显示出良好的平台普适性。上述结果全方位证实SPAC-seq作为高通量空间CRISPR筛选平台的稳健性。

配套工具包TARDIS作为空间扰动数据分析专用统计工具，可完成sgRNA空间坐标校正、扰动富集统计、微环境通路富集、配体-受体空间互作解析等全流程分析，能够批量解析高通量SPAC-seq多维数据，解决空间扰动筛选数据计算复杂、缺乏标准化分析流程的痛点，相关代码已开源。

图1. SPAC-seq支持在基于测序的空间转录组平台上同时进行CRISPR筛选和基因表达分析

接下来，研究团队通过三个不同的研究场景展示了SPAC-seq的实用性。

为研究肿瘤转移早期的细胞定植与微环境互作，研究团队利用MC38细胞尾静脉注射构建小鼠肺转移模型，14天后采集肺转移灶进行SPAC-seq分析。结果显示，sgRNA信号集中在肿瘤病灶，大多数转移灶仅携带单一sgRNA扰动，提示肿瘤细胞定植后局部克隆扩增；通过DBSCAN与CellCharter，将转移灶分类为免疫浸润、免疫排斥两大微环境亚型。进一步，使用TARDIS识别出138个、48个分别在免疫浸润性、免疫排斥性微环境中显著富集的克隆性扰动。

Icam1缺失的肿瘤细胞在肺转移中表现出显著的扩增优势，并高度富集于免疫排斥型微环境；参与MHC信号和TCR共刺激的基因扰动也在免疫排斥型微环境中显著富集。空间共表达分析显示，Icam1缺失破坏了肿瘤细胞与T细胞之间免疫突触的形成，造成病灶CD8⁺T细胞大量减少、M2型抑制性巨噬细胞富集；ICAM1敲除区域IFN-γ信号通路下调、细胞周期相关通路异常激活，巨噬细胞呈现出M2样极化特征，免疫抑制性标志物Spp1、Cd163等表达升高，而促炎因子IL12 、Cxc9、Cxc10表达下降。多重免疫荧光与组织病理染色证实，ICAM1敲除显著提升肿瘤肺转移病灶体积、降低瘤内T细胞浸润比例，明确ICAM1是调控肿瘤转移免疫监视的关键靶点。

图2. TCR共刺激的丧失促进肿瘤定植和免疫排斥

研究团队利用SPAC-seq结合两步筛选策略，系统识别了调控CD8+ T细胞在肿瘤微环境中空间定位的关键基因。筛选结果显示，CD44是影响T细胞空间分布与功能的核心基因。Cd44敲除的OT1 T细胞显著富集于IFN应答和抗原呈递富集的免疫激活区域，与Spp1阳性巨噬细胞的共定位明显减少。

分子机制上，CD44敲除可显著降低T细胞线粒体活性氧水平，上调T细胞记忆、干性相关基因及IFN应答通路，增强IFN-γ、TNF-α等效应因子分泌，改善T细胞记忆表型。体外杀伤实验与体内过继转移模型均表明，CD44缺失会强化CD8⁺T体内抗肿瘤杀伤能力，抑制肿瘤生长、降低耗竭标志物TIM3表达。

图3. CD44通过调控线粒体活性氧水平限制T细胞抗肿瘤免疫

空间测序及配体-受体分析显示，Spp1SPP1由肿瘤相关巨噬细胞分泌，是与Cd44相互作用最强的配体；当CD44缺失时可打破二者相互作用，使T细胞远离抑制性巨噬细胞。机制上，SPP1通过CD44增加T细胞内铁离子和线粒体活性氧水平，诱导铁死亡、T细胞耗竭并抑制糖酵解，而CD44敲除可逆转这些效应，恢复T细胞的效应功能和代谢适应性。体内条件敲除Spp1或使用抗SPP1抗体可显著降低CD44野生型T细胞的线粒体活性氧水平，改善肿瘤控制效果，而对CD44缺失T细胞影响有限。

TCGA人结直肠癌数据证实，SPP1高表达伴随M2巨噬细胞浸润上升、CD8⁺T细胞浸润下降，且SPP1/CD44共高表达患者免疫检查点抑制剂应答率偏低、预后更差，明确SPP1-CD44轴是肿瘤微环境中抑制 CD8⁺T 细胞抗肿瘤功能的关键靶点，具备临床转化价值。

图4. 靶向SPP1-CD44轴可消除CD8 T细胞的抑制

为了解CD8+ T细胞内在状态如何影响其对微环境趋化信号的响应，研究团队分析了超过32万个人类和小鼠肿瘤浸润CD8+ T细胞的单细胞转录组数据，筛选出104个具有空间互斥关系的基因对，这些基因显著富集于趋化因子受体（如CXCR6、CCR7）和转录因子（如TCF7、BHLHE40）。通过体内Perturb-seq和SPAC-seq联合筛选，研究团队发现BHLHE40与CXCR4之间存在负向调控关系。Bhlhe40敲除后Cxcr4表达显著上调，促使CD8+ T细胞更倾向于定位于纤维化区域而非肿瘤实质区域，且与CXCL12阳性细胞的共定位显著增强。

功能上，Bhlhe40缺失的OT1 T细胞效应表型增强、耗竭水平下降，但因滞留瘤周间质，无法深入肿瘤实质杀伤癌细胞，最终导致体内抗肿瘤效果减弱，这提示其空间位置的改变影响了抗肿瘤效应的发挥。该结果首次揭示了转录因子-趋化因子受体调控轴，从空间层面解释T细胞内在分化状态与组织原位定位的协同调控规律。

图5. Bhlhe40通过将细胞状态与趋化性联系来调控CD8 T细胞定位

综上所述，该研究首次系统建立了适用于空间转录组平台的高通量CRISPR筛选体系，打通了基因功能扰动、空间表型、微环境互作和信号通路解析之间的技术屏障。SPAC-seq与TARDIS的组合为未来在肿瘤免疫、发育生物学、神经科学等领域的空间功能筛选提供了可扩展、高分辨率的解决方案。

Tags： Cell | 曾泽贤/潘登/冯驭团队开发SPAC-seq新技术，实现空间分辨率下高通量CRISPR筛选