干眼症是一种常见疾病，其全球患病率约为11.59%，在亚洲地区则高达20.1%。在干眼症的发展过程中，衰老是影响其发展的关键因素。具体而言，干眼症的患病率随着年龄的增长呈现出上升趋势，影响范围覆盖了高达9.2%的60岁以上老年人群。在治疗手段方面，干眼症的治疗已从传统的人工眼泪使用，逐步发展至当前的抗炎疗法。然而，鉴于干眼症症状随年龄增长而加剧，单纯依靠补充泪液和抗炎治疗，难以有效应对由衰老引发的干眼症。

杞菊地黄丸（QJDHW），在六味地黄丸的基础上，融入了枸杞与菊花两味药材，广泛应用于视力模糊的治疗之中。然而，其在年龄相关性干眼症治疗方面的具体机制，目前尚未明晰。近期，一篇题为“Mechanistic elucidation of QiJu-DiHuang Wan in management of age-related dry eye through metabolomics and network pharmacology”的研究论文，针对这一问题展开了深入探讨。

图1 论文首页

QJDHW治疗干眼症治疗的核心信号通路

该研究通过ChEMBL数据库及TCMIO平台分析，在QJDHW及其入血代谢物中共鉴定出24种代谢物，并获取了102个相关靶点。进一步利用TTD与DisGeNET数据库，针对特定疾病筛选得到3144个靶点，其中62个靶点为两者交集。在Cytoscape 3.9.1软件中，经过评分计算，确定了9个关键基因，涵盖3种药物代谢相关酶（即CYP1A1、CYP2C9和CYP2C19）、铁死亡相关蛋白TPGS2，以及TP53、EGFR、ESR1和HIF1A。GO富集分析结果显示，这些关键基因与外源性刺激、营养水平、不饱和脂肪酸代谢、活性氧代谢、类固醇代谢、氧化应激、缺氧以及对氧水平降低的反应等过程密切相关。KEGG分析则揭示了92个显著富集的通路，涉及卵巢类固醇生成、Th17细胞分化、HIF-1信号通路、抗氧化特性、过氧化物酶体、凋亡、雌激素信号通路、p53信号通路、细胞周期、细胞衰老、PI3K-Akt信号通路、铁死亡以及其他相关信号通路（图2）。

图2 网络药理学分析

含QJDHW血清、H₂O₂、抑制剂和激活剂对细胞活性测定

该研究利用细胞增殖与细胞毒性（CCK-8）检测手段，对细胞活性进行测定，最终确定以200μmH2O2处理2小时作为建模浓度，而含QJDHW的血清浓度为20%、SC79浓度为10ng/mL、MK-2206浓度为2.5μm/mL、莫利司他浓度为10μm/mL、KC7F2浓度为5μm/mL时，为最佳的干预浓度。此外，研究还观察到，加入含QJDHW的血清后，细胞活性显著提升，即便在含QJDHW的血清中分别加入抑制剂或激活剂，均表现出较高的细胞活性，这进一步证明了含QJDHW的血清对细胞活性具有积极作用（图3）。

图3 细胞活性检测

ROS含量的测定

经流式细胞术检测确认，相较于对照组，模型组及激活剂莫利司他组的活性氧（ROS）水平呈现显著上升趋势。与模型组对比，激活剂莫利司他组的ROS水平进一步显著升高；然而，抑制剂KC7F2处理组、激活剂莫利司他联合QJDHW血清组，以及单独加入QJDHW血清组的ROS水平均呈现显著下降趋势。此结果表明，QJDHW血清对ROS水平具有明确的抑制作用。MitoSOX染色结果进一步揭示，模型组及莫利司他组的核ROS表达量显著增高，而经KC7F2处理后，核ROS表达量显著降低。此外，添加含有QJDHW的血清同样导致核ROS水平显著下降（图4）。

图4 (A)流式细胞术检测不同组的ROS含量；(B)MitoSOX染色检测细胞核内ROS的表达;(C-D)Western blotting检测HIF-1α、p65、p-p65和p50蛋白表达

Western blot检测HIF-1α、p65、p-p65和p50蛋白表达

经过H2O2及激活剂莫利司他的处理后，HIF-1α蛋白水平呈现显著增加的趋势，而在抑制剂KC7F2的作用下则显著降低。此外，当添加含有QJDHW的血清进行处理时，HIF-1α的表达水平出现下降；若该血清与莫利司他联合使用，则HIF-1α的表达水平显著上升；若与KC7F2联合使用，则表达水平显著降低。同时，研究对NF-κB信号通路中的蛋白p65、p-p65及p50的表达情况进行了检测，结果显示，在H2O2及激活剂莫利司他的作用下，这些蛋白的表达水平显著上升，表明H2O2能够激活NF-κB信号通路；而在抑制剂KC7F2的干预下，其表达水平则显著降低。此外，含有QJDHW的血清干预后，p65、p-p65及p50的水平均显著降低；当该血清与莫利司他联合使用时，蛋白表达水平显著上升；而与KC7F2联合使用时，表达水平则显著降低（图4C-D）。

结果表明，HIF-1α在受到H2O2激活的同时，NF-κB也被激活，二者在氧化应激过程中发挥协同作用。而含有QJDHW的血清则通过抑制HIF-1α及NF-κB的活性，从而减轻氧化应激所造成的损伤。

细胞凋亡检测

与对照组相比，经过H2O2及其干预处理（p<0.0001）后的细胞凋亡水平（以绿色标记）呈现出显著高于对照组的趋势。然而，在向含有QJDHW成分的血清（p<0.001）中添加KC7F2物质后，细胞的凋亡率出现了显著降低，这提示含有QJDHW成分的血清具有减少细胞凋亡的作用。当含有QJDHW成分的血清与莫利达药物共同使用时，细胞的凋亡百分比有所上升，但仍保持在低于模型组的水平，这表明含有QJDHW成分的血清可能在一定程度上抵消了莫利司他的作用效果。而在含有QJDHW成分的血清与KC7F2物质联合干预的情况下，细胞的凋亡率得到了明显的降低，提示含有QJDHW成分的血清与KC7F2物质的联合应用能够降低由H2O2介导的氧化应激所诱导的细胞凋亡（图5）。

图5 (A)流式细胞术检测不同细胞组的细胞周期(B)TUNEL染色检测细胞凋亡(C)Western blotting 检测CCND1 和Bcl-2蛋白表达

结论

研究表明，QJDHW的构成组分具有复杂性。具体而言，其发挥治疗与年龄相关干眼症功效的血液进入成分，主要通过展现抗氧化特性来实现。这一过程主要通过抑制ROS及HIF1α/NF-κB信号通路，并激活PI3K/AKT信号通路，从而达到保护泪腺上皮细胞的效果。

参考文献：

Shi J, Fang C, Liu Q, Chen X, Chen H, Tian S, Peng Q, Yao X. Mechanistic elucidation of QiJu-DiHuang Wan in management of age-related dry eye through metabolomics and network pharmacology. Phytomedicine. 2024 Sep;132:155884. doi: 10.1016/j.phymed.2024.155884

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