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随着年龄增长，大脑白质会逐渐退化，表现为髓鞘结构异常、轴突损伤和认知功能下降。这种退变与神经炎症密切相关，但具体机制尚未阐明。近年研究发现，衰老大脑中会出现小胶质细胞（microglia）异常激活和CD8⁺T细胞浸润的现象，但这些免疫细胞如何相互作用并加剧神经退变仍未明确。

德国慕尼黑工业大学神经细胞生物学研究所Janos Groh团队在Nature子刊《Nature Neuroscience》发表的一项研究，揭示了衰老过程中小胶质细胞的适应性不良激活会通过CXCL10-CXCR3轴募集致病性CD8⁺T细胞，加剧有髓轴突退化及大脑功能损伤和行为障碍，为靶向干预衰老相关神经退行性疾病提供了全新靶点。

为探究小胶质细胞在白质老化过程中的作用，选取成年（12月龄）、老年（24月龄）、老年PLX5622处理（18-24月龄持续给药，靶向CSF-1R耗竭小胶质细胞）和老年Cx3cr1^gfp/gfp（CX3CR1缺陷）小鼠，以视神经为研究对象，通过免疫荧光、电镜等技术分析小胶质细胞表型变化。

免疫荧光检测显示，老年小鼠视神经中CD11b⁺小胶质细胞数量较成年小鼠显著增加，CD11c⁺激活型小胶质细胞比例也明显升高。PLX5622处理可部分耗竭小胶质细胞，但剩余小胶质细胞中CD11c⁺比例显著升高。CX3CR1缺陷不影响小胶质细胞数量，但同样导致CD11c⁺细胞比例上升（P=0.01）。PLX5622处理后的老年小鼠小胶质细胞形态更接近阿米巴样，分支减少，且胞内积累大量自荧光溶酶体储存物和髓鞘碎片，而CX3CR1缺陷小鼠的小胶质细胞虽保留更多分支结构，但同样表现出CD11c高表达。流式细胞术和免疫荧光证实，PLX5622处理后剩余的小胶质细胞几乎不表达稳态标志物P2RY12，主要为CD11c⁺P2RY12^-表型，提示其稳态功能丧失。电镜分析进一步显示，这些小胶质细胞内含有过量髓鞘碎片、溶酶体储存物和少量脂滴，吞噬功能异常。

图1 老年小鼠视神经中小胶质细胞对PLX5622处理或CX3CR1缺陷的应答

作者利用电子显微镜进行详细的形态测量定量分析，结果显示与成年小鼠相比，老年小鼠视神经中髓鞘冗余或断裂的纤维比例显著升高。PLX5622处理或CX3CR1缺陷会进一步加剧这一表型，形成复杂的、相互缠绕的冗余髓鞘结构。此外，PLX5622处理阻止了老年小鼠中观察到的非髓鞘化轴突数量轻微上升的现象，但对薄髓鞘化轴突没有影响。电镜估算显示，老年小鼠视神经轴突总数减少，而PLX5622处理或CX3CR1缺陷会导致轴突丢失更显著，轴突球体形成和退化轴突的比例也显著升高。免疫荧光检测证实非磷酸化神经丝蛋白（SMI32⁺）轴突球体数量在PLX5622处理或CX3CR1缺陷小鼠中显著增多，增强的轴突变性导致RBPMS⁺视网膜节细胞（RGCs）更严重的损失，并通过光学相干断层扫描（OCT）测得内层视网膜明显变薄。自动视动反应分析显示，老年小鼠视觉敏锐度已有所下降，而PLX5622处理或CX3CR1缺陷会进一步加剧这一功能障碍，与结构损伤结果一致。

图2 PLX5622处理或CX3CR1缺陷加剧衰老相关髓鞘损伤和轴突退化

为了进一步表征在衰老过程中使用PLX5622处理时胶质细胞的反应，作者从固定的小鼠脑组织中分离并筛选了单个非神经元细胞（NeuN⁻ DAPI⁺），用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）。在经过质量控制和数据过滤后，对来自成年、老年以及PLX5622处理的老年小鼠的小胶质细胞进行了亚群聚类分析。小胶质细胞耗竭组的加入导致了一个额外的第三类白质相关小胶质细胞（WAM）簇的形成，该簇似乎代表了一种混合状态，表现出先前鉴定的两种WAM亚群的差异表达基因特征，并且在经PLX5622处理的老年小鼠中显著积累。其中一个WAM簇富集了与炎症反应、白细胞活化、脂蛋白清除、糖酵解和NF-κB信号通路相关的基因；另一个WAM簇则富集了与核糖体组装、氧化磷酸化、吞噬作用、II型干扰素（IFN）反应和铁摄取相关的基因；第三个由PLX5622诱导富集的簇则主要涉及炎症反应、抗原加工与呈递、T细胞介导的免疫反应和氧化磷酸化等通路。免疫组化结果进一步显示，抑制CSF-1R可优先减少稳态小胶质细胞，并增加与激活和衰老相关基因的表达。不同小胶质细胞簇对CSF-1R抑制的耐受性与其Csf1r表达下调以及支持其存活的替代受体基因表达上调相对应。此外，残留的小胶质细胞中与促炎性激活、T细胞刺激、溶酶体功能障碍和铁摄取相关的基因表达也明显上调。当聚焦于少突胶质细胞和星形胶质细胞在衰老过程中的转录变化时，发现经PLX5622处理后，衰老相关的少突胶质细胞状态组成变化并不显著。然而，当作者将PLX5622处理的老年小鼠与未处理老年小鼠进行比较时，发现其少突胶质细胞中与蛋白质折叠、DNA损伤和细胞应激相关的基因显著上调。

此外，在老年小鼠的大脑中检测到反应性星形胶质细胞的比例升高，这一现象在PLX5622处理后进一步增强。这些反应性星形胶质细胞表现出与之前在疾病、神经炎症和衰老过程中鉴定出的神经炎症和潜在神经毒性状态高度重叠的转录特征。未在PLX5622处理的老龄小鼠大脑中观察到外周髓系细胞（树突状细胞、单核细胞和中性粒细胞）频率的代偿性增加。综上所述，在老年小鼠中，PLX5622处理或CX3CR1缺失会损害小胶质细胞的稳态功能，导致促炎性小胶质细胞相应增加，髓鞘完整性受损，轴突发生退变，并伴随视觉功能下降。

图3 单细胞RNA测序（scRNAseq）揭示PLX5622处理诱导的衰老相关小胶质细胞特征

为了探讨促炎性激活增加和功能失调如何导致髓鞘纤维损失的加剧，作者对适应性免疫反应进行了表征，这类反应已知会引发与衰老相关的白质损伤。免疫荧光显示，老年小鼠视神经中CD8⁺ T细胞数量较成年小鼠显著增加，PLX5622处理或CX3CR1缺陷会进一步加剧CD8⁺T细胞浸润，而CD4⁺T细胞数量无明显变化。此外，不同PLX5622处理方案（18-24月龄、12-24月龄、0-24月龄连续治疗）均能导致CD8⁺T细胞数量的增加和轴突损伤现象。

scRNA-seq分析显示，老年PLX5622处理小鼠的T细胞集群从CD4⁺Th1细胞标志物表达向CD8⁺ T细胞标志物（Cd8a）偏移，且这些CD8⁺T细胞类似组织驻留记忆T细胞（TRM），高表达效应分子和滞留分子，缺乏组织迁出标志物。与成年和老年小鼠相比，老年PLX5622处理小鼠的CD8⁺ T细胞中细胞毒性效应蛋白酶颗粒酶B（GZMB）的表达比例显著升高（P<0.001）。超分辨荧光显微镜证实，视神经中的CD8⁺ T细胞常与CD11c⁺小胶质细胞接触，且胞内含有GZMB颗粒。免疫荧光显示，PLX5622处理或CX3CR1缺陷小鼠中，CD8⁺T细胞（尤其是GZMB⁺CD8⁺T细胞）更频繁地靠近SMI32⁺轴突球体，提示其直接参与轴突损伤过程。

图4 适应不良的小胶质细胞激活促使CD8⁺ T细胞在老年小鼠脑白质区域的募集

为了明确PLX5622处理后加重的神经退化是否是由CD8⁺ T细胞积累增加介导的，作者用PLX5622处理了老年（18-24月龄）Cd8^-/-小鼠和老年野生型（WT）小鼠，进一步比较两组的髓鞘结构、轴突状态和视觉功能。免疫荧光显示，PLX5622处理后老年Cd8^-/-小鼠和老年WT小鼠的小胶质细胞耗竭效率、CD11c⁺激活比例无显著差异。电镜分析证实，两组中髓鞘冗余或断裂的纤维比例也无明显区别，提示CD8⁺ T细胞不影响小胶质细胞激活和髓鞘结构异常。与老年WT小鼠相比，老年Cd8^-/-小鼠在PLX5622处理后，SMI32⁺轴突球体数量显著减少，轴突退化比例降低，轴突总数丢失减少。同时，RBPMS⁺ RGC数量减少和视网膜NFL/GCL/IPL层变薄的现象也得到明显缓解。视动反应分析显示，PLX5622处理的老年Cd8^-/-小鼠视觉敏锐度显著高于PLX5622处理的老年WT小鼠，从而证实CD8⁺ T细胞的存在是PLX5622加剧老年小鼠视觉功能损伤的关键因素。

图5 CD8⁺T细胞促使接受PLX5622处理的老年小鼠出现更严重的轴突退化现象

为探究“激活的小胶质细胞如何调控老年白质中CD8⁺ T细胞募集”这一核心问题。作者采用多重抗错荧光原位杂交（MERFISH）技术，针对500个基因的定制面板，对成年、老年和老年PLX5622处理小鼠的视神经切片进行空间转录组学分析。该方法能够识别视神经实质及脑膜结构中的所有主要细胞类型，并检测它们对特定基因的表达情况。老年PLX5622处理小鼠中，成纤维细胞/壁细胞和星形胶质细胞比例增加，少突胶质细胞的比例有下降趋势，T细胞数量在切片中数量最多。进一步研究发现，衰老导致少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的激活评分升高，而PLX5622处理会进一步提高小胶质细胞激活标志物的表达。邻近分析显示，T细胞最近邻的50个细胞中，趋化因子（Cxcl10）和反应性少突胶质细胞标志物（Serpina3n）的表达显著富集。进一步空间定位显示，CD8⁺ T细胞优先分布在反应性少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞附近，且这些区域中促炎激活标志物表达升高。

图6 PLX5622处理后老年小鼠视神经的空间分辨单细胞转录组学

为直接研究CXCL10是否参与CD8⁺ T细胞在衰老白质中的募集，作者使用Cxcl10^-/-小鼠，比较成年、老年野生型（WT）和老年Cxcl10^-/-小鼠的小胶质细胞表型、T细胞浸润和轴突损伤。免疫荧光结果显示，老年Cxcl10^-/-小鼠和老年WT小鼠的CD11b⁺小胶质细胞数量、CD11c⁺激活比例无显著差异。电镜分析证实，两组中髓鞘冗余或断裂的纤维比例也无明显区别，提示CXCL10不影响小胶质细胞激活和髓鞘结构异常。与老年WT小鼠相比，老年Cxcl10^-/-小鼠视神经中CD8⁺ T细胞数量显著减少，证实CXCL10是CD8⁺T细胞募集的关键趋化因子。此外，老年Cxcl10^-/-小鼠的SMI32⁺轴突球体数量、轴突退化比例均显著低于老年WT小鼠，RBPMS+ RGC数量减少和视网膜变薄的现象得到缓解，视觉敏锐度也保持在较高水平。

图7 CXCL10介导老年小鼠视神经中CD8⁺ T细胞募集和轴突退化

作者向20月龄Rag1^-/-小鼠（缺乏成熟T/B细胞）静脉注射WT或Cxcr3^-/-供体的骨髓，构建骨髓嵌合体小鼠，在22或24月龄时分析视神经中T细胞浸润和轴突损伤。流式细胞术证实，骨髓移植后，Rag1^-/-小鼠外周T细胞系统得到重建。免疫荧光显示，22月龄时，WT和Cxcr3^-/-骨髓嵌合体小鼠视神经中CD8⁺T细胞数量无显著差异，但24月龄时，Cxcr3^-/-骨髓嵌合体小鼠的CD8⁺ T细胞数量显著低于WT嵌合体，提示CXCR3对CD8⁺ T细胞的长期滞留至关重要。与WT骨髓嵌合体小鼠相比，Cxcr3^-/-骨髓嵌合体小鼠24月龄时SMI32⁺轴突球体数量显著减少，证实CXCR3介导的CD8⁺ T细胞滞留参与轴突损伤。这些结果表明，CXCR3信号通路促进了与中枢神经系统相关的CD8⁺ T细胞的长期存在和组织驻留程序。作者进一步检测了TCF1（一种对干细胞特性和中枢神经系统驻留至关重要的转录因子）的表达水平，免疫荧光显示，Cxcr3^-/-骨髓嵌合体小鼠视神经中TCF1⁺ CD8⁺ T细胞比例显著低于WT嵌合体，提示CXCR3通过调控TCF1表达影响CD8⁺ T细胞的组织驻留能力。

图8 造血细胞CXCR3缺陷减弱老年小鼠视神经中CD8+ T细胞的滞留和持续存在

该研究整合了药理学干预、遗传学模型、形态学分析、单细胞测序、空间转录组学和行为学检测等多种技术，揭示了衰老相关白质退化的全新机制，证实小胶质细胞的适应性不良激活会通过CXCL10-CXCR3轴募集致病性CD8+ T细胞，加剧有髓轴突退化及大脑功能损伤和行为障碍。这一发现不仅加深了对衰老相关神经炎症的理解，还为开发靶向免疫调控的神经保护策略提供了关键理论依据，有望为老年人群的脑健康维护和神经退行性疾病的干预带来新的突破。