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背景介绍
mRNA疗法作为一种变革性的治疗方式，因其能够实现瞬时蛋白表达同时规避基因组整合风险而具有显著优势。这一独特特性使mRNA疗法在疫苗、蛋白替代疗法和基因编辑等领域具有广泛适用性。COVID-19大流行凸显了mRNA技术的转化潜力，mRNA疫苗的临床成功不仅展示了基于mRNA的治疗效果，也确立了脂质纳米颗粒作为核酸递送领先非病毒载体的地位。尽管肝靶向mRNA-LNP递送已显示出巨大前景，但对肺外应用的兴趣日益增长。肺靶向mRNA-LNP递送在治疗遗传性肺部疾病、肺部感染、原发性肺癌及转移性病灶方面具有显著潜力。然而，肺靶向LNP仍面临关键的安全挑战，如血栓形成和免疫系统激活等不良效应即使在相对较低剂量下也普遍存在，限制了mRNA疗法的治疗窗口。解决这些安全问题对于充分实现肺靶向mRNA-LNP递送系统的临床潜力至关重要。
研究思路
针对上述挑战，北京大学未来技术学院程强教授团队开发了一种基于可电离阳离子脂质Lipid-392的肺靶向LNP制剂，通过系统优化实现了高效与安全的统一。研究团队首先制备了一系列不同脂质组分比例的LNP，并在高剂量（5 mg/kg）下系统评估其递送效率和安全性，确定了G8（90% Lipid-392）为首选配方。随后通过精细优化：固定DMG-PEG（1.5%）和Lipid-392（90%），系统增加DSPC并减少胆固醇，得到G8-5；进一步筛选辅助磷脂，发现POPE效果最佳；优化N/P比为10；并系统比较了柠檬酸和醋酸缓冲体系，确定20 mM醋酸缓冲液（pH 4.0）为最优。最终获得了简化的三组分肺靶向LNP，命名为Lipid-392 stLNP（简化靶向LNP），由90% Lipid-392、8.5% POPE和1.5% DMG-PEG组成，N/P比为10。该制剂实现了超过100倍的递送效率提升，靶向特异性高达99%，即使在12 mg/kg高剂量下仍耐受良好。在体内，Lipid-392 stLNP高效递送mRNA至内皮细胞和上皮细胞，实现约70%的基因编辑效率。重复给药不降低mRNA递送效率。在急性肺损伤模型中，IL-10 mRNA的递送显著减轻炎症反应。此外，Lipid-392 stLNP还可共递送ABE mRNA和sgRNA实现基因编辑，以及递送siRNA实现基因沉默，中位有效剂量约为0.05 mg/kg。相关内容以Optimization of Lipid Nanoparticles for Safe and Versatile Lung-Targeted RNA Delivery and Disease Therapy为题，发表在ACS Nano！
图片解析
图1. 通过综合评估递送效率和安全性确定初始LNP配方： (a) LNP脂质组分（Lipid-392、DSPC、胆固醇、DMG-PEG2000）及Lipid-392摩尔比（0%-100%）筛选策略示意图。(b) G1至G9各配方详细脂质组成。(c,d) 代表性体内发光图像及主要器官定量分析显示，肺靶向效率从G1到G8逐渐增强。(e) 脾、肝、肺中萤光素酶表达分布，显示优化LNP配方的优异肺靶向特异性。(f,g) 对候选配方（G5-G8）进行生物相容性评估：注射空LNP后6和24小时分析肝功能标志物（ALT）、肾功能标志物（UREA）及炎症细胞因子（IL-6、TNF-α）。G8表现出最佳安全性和效率平衡。
图2. 通过精细调控优化Lipid-392 LNP实现高递送效率和耐受性： (a,b) 对G8进行后续优化：固定DMG-PEG（1.5%）和Lipid-392（90%），系统增加DSPC并减少胆固醇（G8-1至G8-5）。G8-5萤光素酶表达最高，约为G8-2的1.9倍。(c,d) 使用G8-5比例筛选辅助脂质，POPE最有效。(e,f) N/P比优化，最终优化配方（Lipid-392 stLNP）由Lipid-392/POPE/DMG-PEG以90:8.5:1.5摩尔比和N/P=10组成。(g,h) 对空Lipid-392 stLNP进行体内毒性评估：给药脂质量相当于RNA剂量5-12 mg/kg，6、24、48小时分析肝功能（ALT、AST）、肾功能（UREA、CREA）及炎症细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL-2）。大多数参数在48小时恢复至与PBS对照组相当的水平。
图3. 通过进一步优化配方缓冲液建立Lipid-392 stLNP及理化性质表征： (a-c) 不同缓冲液中Lipid-392 stLNP的体内萤光素酶表达及器官分布。20 mM醋酸缓冲液（pH 4.0，B6组）表现最优，肺表达比其他缓冲液高约8倍。(d) 通过TNS法测定Lipid-392 stLNP的pKa值为7.67。(e) Lipid-392 stLNP的冷冻电镜图像，显示球形、分散良好、直径<100 nm。(f,g) Lipid-392 stLNP与DOTAP-5-LNP的体内性能比较。Lipid-392 stLNP介导的发光信号比DOTAP-5-LNP高约5倍，肺靶向特异性>99%。(h) 高剂量（1.0 mg/kg）注射后全身毒性谱：Lipid-392 stLNP与PBS相当，而DOTAP-5-LNP诱导显著升高。
图4. Lipid-392 stLNP表现出高肺递送特异性和Cre介导的肺基因编辑： (a) 实验设计：静脉注射包裹Cy5标记mRNA的Lipid-392 stLNP，6小时后收获器官进行荧光成像和流式分析。(b,c) 离体荧光图像及定量显示肺、肝、脾中Cy5-mRNA信号，肺平均荧光强度最高。(d) 流式分析显示约78%上皮细胞、82%内皮细胞和50%总肺细胞成功递送mRNA。(e) 基因编辑实验：注射包裹Cre mRNA的Lipid-392 stLNP，48小时后分析。(f,g) Ai14小鼠离体荧光图像及定量显示肺中tdTomato荧光最强。(h) 流式分析显示上皮细胞编辑效率约70%，内皮细胞约68%，免疫细胞约32%，总肺细胞约37%。
图5. Lipid-392 stLNP促进mRNA重复给药治疗和基因编辑： (a) 单次（0.75 mg/kg）或重复（每48小时）给药实验时间线。(b,c) 单次给药后肺中代表性IVIS图像及总通量定量，信号可持续至48小时。(d,e) 重复给药后肺中代表性IVIS图像及总通量定量，每次注射后发光均反弹至可比峰值。(f) 共递送ABE mRNA和sgRNA以纠正TAG终止密码子为CAG，恢复EGFP表达。(g) 高通量测序确定的靶点编辑效率为3.24%。(h) 肺切片EGFP荧光图像显示成功基因编辑。(i) LPS诱导急性肺损伤模型时间线。(j,k) ELISA定量肺组织匀浆和BALF中TNF-α和IL-6水平，IL-10 mRNA治疗显著降低炎症因子。
图6. Lipid-392 stLNP介导肺中有效的siRNA沉默： (a) Lipid-392 stLNP介导Tie2敲低实验时间线。(b) 不同剂量siTie2处理后小鼠肺组织中Tie2蛋白Western blot分析。(c) 剂量-反应曲线显示相对Tie2 mRNA敲低，半最大有效剂量为0.056 mg/kg。(d) EGFP敲低实验时间线。(e) 肺组织切片荧光显微镜图像，siEGFP组EGFP信号（绿色）显著降低。(f) EGFP mRNA水平定量，siEGFP处理导致约50%敲低。
结论
本研究系统开发并优化了Lipid-392 stLNP，这是一种简化的三组分LNP，具有强大的肺靶向能力。通过将新设计的可电离脂质Lipid-392与stLNP框架相结合，该新一代LNP同时提高了安全性、递送效率和配方简便性。通过迭代优化脂质组成、辅助磷脂、缓冲体系和配方参数，确定了由90% Lipid-392、8.5% POPE和1.5% DMG-PEG组成、在醋酸缓冲液中形成的优化配方。该LNP表现出显著的肺趋向性和对肺内皮及上皮细胞的高效细胞摄取。重要的是，Lipid-392 stLNP以最小的全身毒性实现了优异的转染效率，优于基于DOTAP的配方，即使在高剂量下也保持优异的生物相容性。除了良好的安全性外，Lipid-392 stLNP还证明与多种RNA模式广泛兼容，支持功能性蛋白表达、精准碱基编辑和肺中有效的siRNA介导的基因沉默。在急性肺损伤小鼠模型中，Lipid-392 stLNP介导的IL-10 mRNA递送有效减轻了肺部炎症和组织损伤。这些发现确立了Lipid-392 stLNP作为肺靶向治疗的一种通用、安全且高效的RNA递送载体，其简单的组成和优异的生物相容性为安全精准的肺外RNA递送提供了通用框架。
原文链接：
https://doi.org/10.1021/acsnano.6c03013