视网膜动脉壅塞(RAO)作为临床高发的致盲性眼科急症，疾病过程伴随缺血缺氧毁伤、神经元病变与免疫应答混乱。眼球组织具备精细的层状解剖构造，传统单细胞转录组技巧可解析细胞异质性，却损掉关键空间地位信息;惯例空间转录组技巧又存在细胞瓜分误差、捕获效力不足、实验成本昂扬等问题。若何应用有限的空间测序样本，实现大年夜范围单细胞数据的精准注释与空间定位，是眼部空间图谱构建、RAO 病灶动态机制研究中亟待冲破的技巧难题。

本研究由武汉大年夜学生命科学学院博士生杜辰、李胤铭博士、硕士生李紫玥作为合营第一作者，武汉大年夜学人平易近病院肖璇传授和武汉大年夜学生命科学学院周宇传授为合营通信作者。

图1、小鼠眼部单细胞分辨率空间转录组分析概述

双平台融合，破解空间组学技巧难题

为解决上述瓶颈，武汉大年夜学研究团队开辟了ASCAL分析流程，融合SeekSpace和Stereo-seq两大年夜平台展结合解析：依托具备单细胞分辨率的 SeekSpace 构建高可托度细胞表达参考图谱，结合 Stereo-seq 覆盖面广、视野完全的特点弥补全域空间定位信息，再串联 eClassifier、CytoSPACE、TopACT 等算法，实现海量单细胞数据的主动化分型与空间定位。基于这套技巧体系，研究完成了今朝覆盖最周全的小鼠全眼单细胞空间图谱绘制，并深度分析 RAO 模型的空间病理特点，为眼部心理、病理研究以及致盲性眼病的靶向治疗，供给了全新的组学研究对象与核心基本数据。

眼球组织具备精细的层状解剖构造，传统单细胞转录组技巧虽能解析细胞异质性，却损掉了关键的空间地位信息;而惯例空间转录组技巧又面对细胞瓜分误差、捕获效力不足、实验成本昂扬等瓶颈。如安在不增长大年夜范围空间测序包袱的前提下，实现海量单细胞数据的精准空间定位，一向是眼部疾病研究中的技巧难题。

研究团队立异性地开辟了ASCAL分析流程，融合SeekSpace与Stereo-seq两大年夜空间组学平台的优势：依托SeekSpace构建单细胞分辨率的高可托度细胞表达参考图谱，结合Stereo-seq覆盖面广、视野完全的特点弥补全域空间定位信息，再经由过程eClassifier、CytoSPACE、TopACT等算法串联，实现高通量单细胞数据的主动化分型与精准空间定位。

基于该技巧体系，研究团队仅应用3张小鼠眼部冷冻切片，即成功捕获17,835个细胞，构建起单细胞分辨率的眼部空间参考图谱，共注释出17类细胞类型，涵盖6类视网膜神经元、3类胶质细胞以及晶状体、睫状体等标记基因稀缺组织的细胞群体。空间邻域富集分析证实，该图谱可以或许精准复现视网膜突触层、角膜基质上皮复合体等原位空间排布特点。

图2、基于SeekSpace参考数据对小鼠眼不合区域单细胞进行主动化细胞类型注释

精准辨认"隐蔽"细胞，避免假性富集

研究进一步证实，基于SeekSpace空间图谱构建的SVM主动分型模型eClassifier，可有效规避人工标记基因注释的主不雅误差，实现跨眼部区域的无偏细胞剖断。在针对RAO病理模型的分析中，eClassifier成功辨认出惯例无监督聚类无法零丁分群的Müller胶质细胞——该类细胞与无监督聚类的Jaccard类似度最高仅为0.04，凸显了精细分型算法在解析转录特点微弱差别细胞类型上的独特优势。

针对眼球中弥散分布的罕见外周免疫细胞，研究团队采取TopACT概率化定位技巧，结合CD14免疫荧光验证，证实外周免疫细胞重要富集于眼外肌及结缔组织，在视网膜区域几乎无阳性旌旗灯号，精准相符血视网膜樊篱的心理规律，有效避免了罕见细胞在视网膜区域的假性富集。

图3、基于Stereo-seq技巧的单细胞空间定位重建

揭示RAO空间特异性毁伤机制

在RAO病理模型研究中，ASCAL体系展示出强大年夜的空间解析才能。研究证实，RAO激发的免疫活化存在明显的空间分布偏好：Müller胶质细胞标记物Vim在造模后3天即于视网膜神经节细胞层(GCL)出现表达上调，7天时GCL与内核层(INL)表达进一步升高;小胶质细胞富集热点数量较对比组晋升10倍以上，且重要定位于GCL，并出现崛起粗短、分支削减的典范活化形态。

更为关键的是，研究初次发明RAO对视杆细胞的毁伤具有亚群选择性。借助SeekSpace的单细胞空间分辨优势，团队剖断出5个视杆细胞亚群，个中位于视网膜外周、具有高翻译活性、Rbp3阳性的C1功能型亚群在RAO造模后占比明显降低，阳性细胞数量近乎减半。这一发明打破了"RAO造成视杆细胞整体性损耗"的传统认知，揭示了疾病对特定功能亚群的选择性进击机制。

图4、RAO引诱的免疫激活空间定位分布

为致盲眼病研究奠定命据基本

研究团队表示，ASCAL整合分析体系的核心价值在于冲破了单细胞与空间转录组数据结合解析的技巧瓶颈——无需大年夜范围空间测序实验，仅依托少量组织切片，即可完成高通量单细胞数据的精准注释与空间定位。这一办法不仅实用于眼部研究，也为其他具有复杂空间构造的组织器官研究供给了可借鉴的技巧范式。

该研究构建的小鼠眼球全域单细胞空间图谱，将为眼部发育、心理功能研究供给高分辨率、完全的基本数据集;而RAO模型中揭示的空间特异性免疫激活及视杆细胞亚群选择性毁伤特点，则为急性致盲性视网膜血管病变的早期诊断标记物发明与新型靶向治疗策略开辟奠定了坚实的理论基本。

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