肝纤维化（Fibrosis）是慢性肝损伤的病理生理结果，其特征是细胞外基质蛋白的过度积累，它的发生与肝损伤后产生自由基（ROS），进而激活肝星状细胞分泌基质蛋白有关。肝纤维化进一步发展形成大量瘢痕组织，会引起肝脏结构的改变和肝功能的受损，最终导致肝硬化和肝功能衰竭的发生。研究报道，超过90%的肝细胞肝癌（HCC）病例发生在慢性肝病的背景下，由肝纤维化发展而致的肝硬化是肝细胞肝癌发生的最强因素。据文献报道，全世界每年约有200万人死于肝病，其中100万人是死于肝硬化，而且肝硬化是第11个最常见的死亡原因，与肝癌一起占全球所有死亡人数的3.5%。因此肝纤维化的治疗是当前一个亟待解决的公共健康问题。

在此背景下，兰州大学李汛教授、姚佳研究员课题组，提出了创新的 “水凝胶+工程化外泌体”靶向治疗策略，开发出一种新型的水凝胶介导的递送平台（CMC-OD/TA-Fe(III)），包封氨基乙酰茴香酰胺（Aminoethyl Anisamide，AEAA）功能化修饰过的天然纳米颗粒-人脐带间充质干细胞来源的外泌体，通过腹腔原位注射方式实现可持续释放靶向活化的肝星状细胞（aHSCs）的外泌体，以减轻慢性肝损伤导致的肝脏纤维化。该治疗体系能够显著降低氧化应激，抑制肝脏细胞周围胶原沉积，为肝纤维化的逆转提供了全新的治疗路径。相关研究成果以“Hydrogel Loaded with Aminoethyl Anisamide-Modified Exosomes Attenuates Hepatic Fibrosis by Targeting Activated Hepatic Stellate Cells”为题，发表在《ACS Nano》期刊上。论文的第一作者是课题组成员孙宗斌博士。

主要内容

图1. CMC/OD/TA-Fe(III)/AEAA-Exos递送体系的设计及应用

作者基于席夫碱反应原理，使用羧甲基壳聚糖（Carboxymethyl chitosan，CMC)，氧化葡聚糖(Oxidized dextran, OD)，单宁酸铁(Tannic Acid-Iron, TA-Fe(III))合成新型的水凝胶递送平台(CMC/OD/TA-Fe(III))。TA-Fe(III)可以增强水凝胶的结构稳定性，继而确保水凝胶/外泌体递送体系能够在复杂的腹腔条件下稳定缓释外泌体。研究报道，氨基乙基茴香酰胺(AEAA)，是sigma受体(Sig-R)的有效配体，而sigma受体过表达于活化的肝星状细胞(aHSCs)表面, AEAA与Sig-R的有效结合，促进了活化的肝星状细胞的摄取效率。因此，本研究将AEAA靶向化修饰具有肝脏修复功能的天然纳米颗粒-人脐带间充质干细胞来源的外泌体，随后，将经 AEAA 修饰的外泌体封装在合成的水凝胶中，构成新型的水凝胶/外泌体递送治疗体系(CMC/OD/TA-Fe(III)/AEAA-Exos，Gel/AEAA-Exos)。通过腹腔注射将水凝胶/外泌体递送系统给肝纤维化模型的 C57BL/6J 小鼠。这种方法实现了外泌体的持续释放，这些外泌体能够特异性地靶向活化的肝星状细胞(aHSCs)。

图2. CMC/OD/TA-Fe(III)/AEAA-Exos递送体系的表征

作者对源自人脐带间充质干细胞（hucMSCs）的外泌体进行了表征。通过透射电镜（TEM）观察到外泌体呈类圆形，纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示源自 hucMSCs 的外泌体粒径分布集中在直径约 135 nm附近。此外，通过蛋白质印迹法鉴定 hucMSCs 衍生物的表型，其表面阳性标志物 TSG101、CD81 和 CD9 呈现清晰条带，证明本研究中提取和纯化的脐带间充质干细胞衍生物为外泌体。通过荧光共定位测试证实 AEAA 成功结合到外泌体上。透射电子显微镜（TEM）表明，AEAA 修饰未对外泌体膜的完整性造成显著损伤。质子核磁共振（¹H NMR）结果显示，与未氧化的葡聚糖的谱图相比，氧化后的葡聚糖谱图在 4.2 - 5.8 ppm 的化学位移范围内出现了几个额外的峰，这些峰被归因于羟基醛结构中的质子。该分析证实了葡聚糖被有效地氧化，这一点从傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析中得到了证明。此外，作者还证实了该递送体系的可注射性、良好的粘弹性，以及适宜的流变学特性、缓释和降解性能，满足了该水凝胶/外泌体递送体系在复杂的腹腔环境中的理化特性需求。

图3. CMC/OD/TA-Fe(III)/AEAA-Exos递送体系的生物学兼容性评估

生物学兼容性涉及材料与宿主相互作用过程中所发生的现象，对于材料在临床应用中的正常运作至关重要。作者通过基于荧光的活/死染色（Calcein-AM/PI）定量评估了水凝胶暴露后 L929 细胞的存活率。同时，测试了不同组水凝胶对 BRL-3A 细胞的活性。此外，将 L929 和 BRL-3A 细胞培养在 CMC-OD、Gel 和 Gel/AEAA-Exos 水凝胶表面进行黏附实验。在本次研究中，通过CCK-8实验评估水凝胶材料的细胞毒性评级达到了 0 级的标准。此外，通过溶血和凝血实验，以及血液纤溶指标水平变化，评估水凝胶递送体系的生物学兼容性。同时，将递送体系植入小鼠体内，通过组织学和血清学评估水凝胶/外泌体递送体系的生物学兼容性。以上结果均表明，该水凝胶/外泌体递送体系具备良好的生物学兼容性能，满足机体组织的安全性需要。

图4. CMC/OD/TA-Fe(III)/AEAA-Exos递送体系的体外生物学特性评估

作者通过分析 aHSCs 和 AML-12 细胞中摄取的外泌体数量，评估了 AEAA 修饰的外泌体的靶向特性。首先，核周定位分析、定量结果和流式细胞术分析（支撑信息中）均表明，AEAA 修饰的外泌体对 aHSCs 具有显著的靶向特性。根据之前的研究结果，以AEAA 作为激活的肝星状细胞表面表达的sigma受体的有效阻断剂。细胞免疫荧光实验和流式细胞术均证明了 AEAA 的靶向能力是由 aHSCs 表面的sigma受体介导的。通过使用 DCFH-DA 探针进行了荧光实验和流式细胞术分析，证实了经 AEAA 修饰的外泌体显著降低了 aHSCs 中的活性氧水平，具有良好的抗ROS作用。此外，细胞荧光定量分析均表明，与未重组的外泌体相比，工程化的外泌体在抑制 aHSCs 中的α-SMA 和 Colla I 表达方面具有更强的疗效（P<0.0001）。同时，RT-PCR 分析显示，AEAA-Exos 组中α-SMA（P<0.01）和 Col1a1（P<0.05）的 mRNA 表达水平显著低于 Exos 组。体外实验表明，凝胶/AEAA-Exos 递送系统显著抑制了肝纤维化的形成。

图5. CMC/OD/TA-Fe(III)/AEAA-Exos递送体系的体内靶向特性评估

作者进一步评估了凝胶/AEAA-外泌体递送系统在动物体内的靶向能力，将游离的 AEAA-外泌体、凝胶/外泌体和凝胶/AEAA-外泌体植入 SD 大鼠体内，并使用小型动物成像仪器在不同时间点评估这三组的外泌体摄取情况。并在不同时间点取出了大鼠的肝脏、心脏、肺脏、肝脏、脾脏和肾脏，比较外泌体在游离的器官中的分布。同时，通过组织免疫荧光共定位法（PKH26标记外泌体）评估AEAA功能化的外泌体对aHSC的靶向性能。结果表明，由 AEAA 改造的外泌体具有良好的靶向功能，而且水凝胶在外泌体的持续释放中起着至关重要的作用。

图6. CMC/OD/TA-Fe(III)/AEAA-Exos递送体系的体内抗纤维化效果评估

作者通过肝脏组织学和血清学评估水凝胶/外泌体系统体内抗纤维化能力。首先以C57BL/6J小鼠腹腔注射CCl₄/橄榄油溶液，建立肝纤维化模型。通过 HE 染色、Masson 染色、天狼星红染色，以及PColla III 、MMP9 作为免疫组化指数评估水凝胶/AEAA-Exos 递送体系的抗纤维化作用。结果证明，水凝胶/AEAA-Exos 递送体系具有显著的抗纤维化效果。此外，通过组织免疫荧光实验，利用 TGF-β 和 α-SMA 来探究递送体系对肝纤维化病变的影响。RT-PCR 分析显示，水凝胶释放的经 AEAA 改良的外泌体能够显著降低α-SMA、Col1a1 和 Col3a1 的基因表达水平（P < 0.01）。结果表明 AEAA 矢量化外泌体对肝组织中活化的肝星状细胞具有更好的靶向能力，并且凝胶/AEAA-外泌体系统能够抑制胶原纤维的生成，延缓肝纤维化的发展，有效缓解肝纤维化。在本研究中，通过测定肝脏组织中氧化还原平衡标志物超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA），来评估 Gel/AEAA-Exos 对肝纤维化中氧化应激的影响。结果证明了 Gel/AEAA-Exos 能有效缓解纤维化的氧化还原失衡，并伴随肝脏胶原沉积的减少，从而证实氧化应激是肝脏纤维化形成的一个致病因素。

图7. CMC/OD/TA-Fe(III)/AEAA-Exos递送体系抗纤维化的机制阐释

作者通过转录组 RNA-测序技术，对 Gel/AEAA-外泌体在肝脏模型中的抗纤维化机制进行了分析。KEGG 通路分析揭示了不同实验组之间存在显著的分子关联，这些发现表明，Gel/AEAA-Exos 系统通过协调氧化应激调节、胶原沉积和炎症反应来减轻肝纤维化的发展。而且，MAPK 通路在Gel/AEAA-Exos 发挥逆转肝纤维化方面起着关键作用。在本研究中，通过 RT-PCR 方法评估了MAPK 通路的核心因子、上游和下游因子（MAP3K13、ASK1、MAPK/P38、MAPK/ERK、HSPB1 和 MMP9）的表达水平。结果表明，与模型组相比，治疗组中 MAP3K13、ASK1、MAPK/P38、MAPK/ERK 和 HSPB1 的表达水平显著降低，而 MMP9 的表达水平则显著升高。关键通路节点基因的变化与 RNA-seq 结果高度一致，这些数据为转录水平上的机制验证提供了直接证据。

全文总结

本研究开发了一种新型的水凝胶/外泌体递送平台，通过局部腹腔注射以及对外泌体的改造，能够持续释放靶向 aHSCs 的外泌体，并在由 CCl₄/橄榄油诱导的肝纤维化小鼠模型中验证了其治疗效果。此外，RNA 测序显示，基于Gel/AEAA-Exos 递送系统能够通过调节肝脏组织中的氧化应激、胶原沉积和炎症反应来减缓肝纤维化的发生和形成。并在基因表达水平，证实了，该递送体系通过MAPK 通路在逆转肝纤维化方面起着关键作用。该平台可能代表了一种新的健康、安全且高效的治疗和预防肝纤维化的方法。 这项工作还展示了 Gel/AEAA-Exos 递送系统在慢性肝损伤和终末期肝病中的应用潜力。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.5c06003

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