工程菌OMVs穿盔甲，助力激活STING通路

cGAS-STING通路作为连接先天免疫与适应性免疫的关键枢纽，在缓解免疫抑制性肿瘤微环境（TME）和提升免疫治疗效果中发挥重要作用。然而研究发现，该通路中的适配蛋白STING在多种恶性肿瘤中普遍处于静息状态。最新证据表明，乳酸（LA）可对cGAS-STING通路进行动态调控，同时LA已被证实是形成免疫抑制性TME的重要介质。降低肿瘤内LA水平可能促进cGAS-STING通路激活并改善免疫抑制性TME，从而增强免疫治疗的临床疗效。

乳酸调控策略

目前已有多种策略用于降低TME中LA的积累，包括抑制糖酵解以阻断LA生成、抑制LA外排或直接利用乳酸氧化酶（LOX）消耗LA。其中，通过基因工程技术将LOX表达于细菌外膜囊泡（OMVs）表面，成为降低病理状态下LA水平的有效手段。更重要的是，OMVs由于含有母体细菌的生物大分子（如脂多糖、肽聚糖、蛋白质和DNA等）而具有强效的免疫刺激特性。然而，OMVs的临床转化面临着生物安全性挑战，尤其是免疫系统过度激活及细胞因子风暴风险。因此，对OMVs进行工程化改造，在保留其病灶部位生物活性的同时提升血液循环中的安全性十分重要。

生物矿化工程菌OMVs，调控乳酸代谢为激活STING通路提供新思路

近期，武汉大学张先正教授、陈巍海教授团队研究开发了一种生物矿化的工程细菌外膜囊泡（OMVs@MnCaP-FA），作为cGAS-STING通路的纳米激动剂，用于增强抗肿瘤免疫治疗。相关工作以“Biomineralized Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as cGAS-STING Nanoagonists Synergize with Lactate Metabolism Modulation to Potentiate Immunotherapy”为题，发表在Journal of The American Chemical Society上。

【文章要点】

该团队通过基因工程改造益生菌株Nissle 1917，使其表达乳酸氧化酶（LOX），之后提取细菌外膜囊泡（OMVs-EcL），并采用叶酸（FA）修饰的锰掺杂磷酸钙进行矿化（图1a）。FA功能化的矿化外壳赋予OMVs@MnCaP-FA肿瘤靶向能力和改善的生物相容性，可避免系统循环中的免疫清除。当被4T1乳腺肿瘤细胞内化后，该纳米壳层在酸性条件下发生响应性降解，同时释放Ca²⁺、Mn²⁺和OMVs-EcL（图1b）。释放的Ca²⁺和Mn²⁺导致活性氧（ROS）大量产生，进而引发严重的线粒体损伤，释放线粒体DNA（mtDNA），后者作为一种内源性危险信号，被cGAS识别。Mn²⁺通过增强cGAS对dsDNA的敏感性来强化cGAS-STING通路激活，从而促进cGAMP生成并加强其与STING的结合。与此同时，OMVs-EcL通过降低LA水平抑制cGAS乳酰化修饰，进一步增强cGAS与dsDNA的静电亲和力，从而促进cGAMP产生和IFN-β分泌。此外，肿瘤来源的mtDNA还能激活树突状细胞中的cGAS-STING通路，产生的IFN-β促进DCs成熟和T细胞活化，从而增强适应性免疫应答。更重要的是，OMVs-EcL还通过消耗LA将免疫抑制性TME重编程为免疫应答状态，最终恢复抗肿瘤免疫效能。实验结果表明，该纳米激动剂不仅能显著抑制原发性肿瘤生长，还能有效减缓肿瘤转移进程。这种将生物矿化工程化OMVs介导的cGAS-STING通路激活与LA代谢调控相结合的协同策略，为推进肿瘤免疫治疗提供了极具前景的新范式。

图1.纳米STING激动剂OMVs@MnCaP-FA的制备及增强抗肿瘤免疫治疗示意图。（a）OMVs@MnCaP-FA的制备过程示意图。（b）OMVs@MnCaP-FA介导的cGAS-STING通路激活及乳酸代谢调控在抗肿瘤免疫治疗中的作用机制示意图。

乳腺肿瘤组织与正常组织乳酸代谢差异分析

作者从多方面进行了比较分析（图2），揭示了乳腺癌肿瘤细胞与正常细胞在乳酸代谢上的显著差异。首先对比了正常细胞系（NIH3T3、L929细胞）和常见的肿瘤细胞（4T1、B16和CT26细胞），发现4T1乳腺癌细胞呈现较高水平的乳酸生成。接着，进行了生信分析，关注了乳酸脱氢酶A（LDHA）、乳酸脱氢酶B（LDHB）和乳酸转运蛋白SLC16A3这三个乳酸代谢相关的标志物。发现4T1肿瘤的LDHA和SLC16A3表达上调，而乳酸消耗相关酶LDHB表达下调。最后，收取小鼠4T1肿瘤组织和乳腺组织进行了蛋白质印迹（Western blot）及免疫组化实验。进一步证实4T1肿瘤组织中LDHA/SLC16A3蛋白水平显著高于正常乳腺组织，同时LDHB表达降低，且乳酸代谢指标（LDHA、SLC16A3）与增殖标志物Ki67呈显著正相关，表明乳酸的异常积累可能促进肿瘤进展。

图2. 乳腺癌与正常组织乳酸代谢差异分析

工程化 OMVs 的制备与表征

作者构建了表达乳酸氧化酶（LOX）的工程化大肠杆菌（EcL），并分离提取了其细菌外膜囊泡（OMVs-EcL）（图3）。相较于野生型OMVs-EcN，OMVs-EcL形貌无明显区别，但展现出显著的乳酸消耗能力。作者通过Western blot实验证实了His-tag的存在，证明了LOX在OMVs-EcL上的成功表达。接着，作者证实了相较OMVs-EcN，OMVs-EcL不仅显著消耗了LA，也抑制肿瘤细胞存活，并且更为有效地激活cGAS-STING通路。

图3. 两种OMVs的表征及功能性评估

生物矿化工程菌OMVs的制备与表征

为了提高STING通路激活的能力，并提高生物安全性，作者对OMVs-EcL进行了生物矿化，并在材料层面上进行了表征（图4）。细胞层面上，作者对其激活STING通路的能力进行了评估并提出了可能的机制：①Ca²⁺和Mn²⁺协同作用诱导大量ROS生成，导致线粒体功能障碍并提升胞质mtDNA水平；②OMVs-EcL介导的LA消耗降低cGAS乳酰化修饰，维持其dsDNA结合活性；③Mn²⁺增强cGAS对dsDNA识别的敏感性，促进cGAMP生成并提高STING结合亲和力，从而激活cGAS-STING信号通路。

图4. 生物矿化的OMVs（OMVs@MnCaP-FA）的表征

作者在4T1乳腺癌、B16黑色素瘤模型、4T1肿瘤转移模型和4T1肿瘤再挑战模型中验证了OMVs@MnCaP-FA的体内治疗和免疫调控效果，并进行了转录组学的分析，进一步阐明其抗肿瘤的机制。

【结论与展望】

最后，作者对OMVs的临床转化前景做出了展望：尽管OMVs的临床转化仍面临若干挑战，包括产量与纯度的平衡、规模化生产工艺的优化、内毒素水平的控制以及长期储存稳定性等问题。目前，通过将工业级发酵罐与超滤系统、切向流过滤、尺寸排阻色谱及内毒素去除技术相整合，已初步建立可规模化的OMVs生产平台。本研究在温和条件下构建了叶酸修饰的锰掺杂磷酸钙矿化层，这种“人工外骨骼”结构显著提升了OMVs的稳定性。然而，矿化过程的批次间差异及OMVs@MnCaP-FA的规模化生产仍是亟待解决的关键问题。未来临床转化可借助微流控芯片技术实现大规模标准化生产。随着技术进步，OMVs在临床应用中展现出广阔前景。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c05148

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