人类6号染色体上的主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）区域编码的人类白细胞抗原（HLA）分子在免疫系统中发挥着至关重要的作用。MHC区域是人类基因组中多态性最为丰富的区域之一，其高度多态性和结构复杂性使得利用传统人类参考基因组（如GRCh38）进行的分析常常存在比对偏差和变异识别错误的问题，这些问题在癌症研究中尤其明显。因此，对肿瘤细胞MHC区域进行精准的单倍型解析和组装，对于研究肿瘤免疫逃逸机制和开发精准的免疫治疗策略具有重要意义。

肿瘤细胞系广泛应用于癌症的分子生物学研究中，比如常用的肺腺癌细胞系A549、宫颈癌细胞系HeLa、肝癌细胞系HepG2、慢性粒细胞白血病细胞系K562和骨肉瘤细胞系U2OS。这些细胞系的MHC区域的高多态性使得常规分析方法存在明显缺陷，因此亟需构建这些肿瘤细胞系MHC区域的精准参考序列。

复旦大学刘赟教授团队在本刊发表题为“Haplotype-Resolved Assemblies of the MHC Region in Five Widely Used Tumor Cell Lines”的文章，整合CRISPR-Cas9介导的靶向富集技术与二代和长读长测序技术，成功实现了上述五种肿瘤细胞系MHC区域的高质量单倍型解析组装，并对该区域的遗传变异、多态性结构及非整倍体现象进行了详细的分析。

图1 基于CRISPR的MHC区域靶向单倍型解析组装流程示意图

1、CRISPR靶向复合测序策略能够显著富集MHC区域的长片段DNA分子

团队设计了针对MHC区域侧翼的特异性CRISPR-Cas9 sgRNA，通过凝胶内酶切与脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术，有效富集了MHC区域DNA片段。后续通过10x Genomics linked-read和PacBio HiFi测序技术对富集DNA片段进行测序分析。实验结果表明，该策略显著提高了MHC区域的测序覆盖率，尤其是A549细胞系测序深度最高可提升至50倍。

图2 基于10x Genomic和PacBio HiFi测序数据展示的A549细胞系靶向测序MHC区域的高覆盖率

2、肿瘤细胞系的MHC单倍型序列组装提升了MHC区域遗传变异解析分辨率

利用测序获得的高质量数据，团队成功实现了五种肿瘤细胞系的单倍型解析组装。其中，A549细胞系展示了卓越的组装连续性，最大组装片段NGA50达到1.1 Mb。组装质量经QUAST、BUSCO和Merqury等工具严格评估，证实了单倍型组装的高准确性和完整性。利用这些单倍型组装，团队实现了肿瘤细胞系单倍型遗传多样性鉴定和8digits的高分辨率HLA基因分型，并验证了多种关联性分型组合。

图3 多维度评估显示肿瘤细胞系单倍型分辨MHC组装的良好完整性和准确性

3、肿瘤细胞系MHC单倍型呈现非整倍体现象

团队研究进一步利用单倍型解析组装，通过公共WGS测序数据，揭示了细胞系MHC区域的非整倍体现象。各肿瘤细胞系的倍型测序深度比例呈现明显差异，如A549为1:1平衡状态，而K562细胞系表现为明显的3:1非整倍体比例，提示可能存在复杂的染色体重排或额外的基因组拷贝变化。

图4 通过细胞系的组装单倍型揭示MHC区域的非整倍性特征

4、总结

本研究首次利用创新的CRISPR-Cas9靶向富集结合长读长测序技术，成功构建了肿瘤细胞系MHC区域的高质量单倍型参考序列，揭示了MHC区域内丰富的遗传多态性和结构复杂性，为深入理解肿瘤免疫逃逸机制提供了重要工具和遗传学资源。同时，这种CRISPR-Cas9靶向富集结合长读长测序的创新方法，可拓展应用于其他复杂基因组区域，为解析人类遗传变异与疾病关联提供有效工具。

文章来源

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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352304225000923

引用这篇文章：

Haplotype-resolved assemblies of the MHC region in five widely used tumor cell lines. Genes Dis. 2025;12(5): 101603.

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