摘要:目的 探索远隔缺血后处理(RIP)对脑缺血-再灌注大鼠运动功能障碍的改善作用和对运动皮质脑源性神经营养因子(BDNF)表达的调控及机制｡ 方法 选用成年雄性Sprague Dawley大鼠制作大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,将大鼠完全随机分为假手术组(Sham组)､MCAO组和RIP组(MCAO + RIP组),MCAO造模成功后24 h对MCAO + RIP组大鼠进行连续21 d RIP干预｡采用旷场实验和转棒实验检测3组大鼠运动功能(包括运动速度､运动总距离及停留时间),蛋白免疫印迹(Western blot)和免疫荧光染色检测大鼠皮质BDNF､酪氨酸激酶受体B(TrkB)的蛋白表达以及神经元核抗原(NeuN)和含半胱氨酸的半胱氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)蛋白的表达水平,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测皮质BDNF信使核糖核酸(mRNA)水平｡点杂交实验和甲基化特性聚合酶链反应(PCR)分别检测大鼠皮质总体的5甲基胞嘧啶(5mC)水平和BDNF的5mC甲基化修饰水平,以及Western blot检测了DNA甲基化相关酶的蛋白表达水平,包括DNA甲基转移酶1(DNMT1)､DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)､DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)和5甲基胞嘧啶羟化酶(TET1),并进行3组间的比较｡ 结果 与Sham组比较,术后第21天旷场实验结果显示,MCAO组大鼠的运动总距离和运动速度减少[(12 ±6)m比(25 ±6)m,(0. 30 ±0. 12)m/ s比(0. 50 ±0. 06)m/ s,均P < 0. 01],术后第22天转棒实验停留时间减少[(11 ± 7)s比(34 ± 12)s,P < 0. 01]｡与MCAO组大鼠比较,MCAO + RIP组大鼠的旷场实验运动总距离[(20 ± 4)m]和运动速度[(0. 44 ± 0. 05)m/ s]增加(均P < 0. 05),转棒实验停留时间[(24 ± 8)s]增加(P < 0.05)｡免疫荧光染色结果显示,与Sham组大鼠比较,MCAO组大鼠运动皮质神经元数量显著减少[阳性细胞数:(19 ± 3)个/视野比(92 ± 6)个/视野,P < 0. 01],但MCAO + RIP组[阳性细胞数:(55 ± 8)个/视野]较MCAO组运动皮质神经元数量增多(P < 0. 01)｡Western blot和RT-qPCR结果显示,MCAO组大鼠皮质的BDNF mRNA和蛋白相对表达水平均较Sham组降低(均P < 0. 05),而与MCAO组比较,MCAO + RIP组BDNF mRNA和蛋白相对表达水平均升高,差异均有统计学意义(均P < 0. 05)｡与Sham组比较,点杂交实验结果显示MCAO组大鼠运动皮质总体5mC修饰水平较高,Western blot结果表明MCAO组DNMT1和DNMT3b蛋白的相对表达水平升高,甲基化特异性PCR结果表明MCAO组 BDNF甲基化水平升高,差异均有统计学意义(均P < 0. 05);与MCAO组比较,MCAO + RIP组皮质总体5mC水平和DNMT1和DNMT3b的蛋白相对表达水平以及相对BDNF甲基化水平均明显降低,差异均有统计学意义(均P < 0. 05)｡ 结论 RIP可能通过调控BDNF的5mC甲基化修饰,使运动皮质BDNF的表达水平升高,从而改善MCAO大鼠的运动功能障碍｡

卒中幸存者遗留学习认知和记忆障碍以及运动障碍,其中运动障碍是卒中后最常见的功能障碍之一,严重影响患者活动,降低患者及其家人的生活质量｡脑缺血后再灌注损伤可以导致患者缺血灶区神经元死亡及神经功能缺失,对患者产生的危害极大,因此亟需寻找和开发有效且安全的治疗干预措施｡远隔缺血处理(remote ischemic conditioning, RIC)是一种极具潜能的治疗方式,主要是通过对器官短暂而不损伤性的适度缺血刺激,达到缺血-再灌注进而激活机体内部的保护机制,使远隔重要脏器耐受长时间的缺血性损伤,从而减轻脑组织损伤,达到神经保护作用｡RIC 可在缺血前预处理､缺血期间和再灌注前或再灌注后处理,与缺血前预处理相比,远隔肢体缺血后处理(remote ischemic postconditioning, RIP)是临床环境中治疗急性缺血性卒中的首选形式,因为其可以在卒中发作期间或发作后应用,并已有大量报道证明其临床的有效性｡然而,RIP 发挥作用的具体机制尚不明确｡

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是一种重要的神经营养因子,通过与高亲和力酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)结合发挥作用｡既往研究证实,外源性BDNF能够有效修复缺血半暗带并保持残余神经元免受大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)的不利影响,BDNF/ TrkB 可能在抑制缺血性脑损伤中的神经元死亡和减轻神经功能障碍方面发挥作用｡而关于RIP是否能够提高BDNF的表达尚不清楚,本研究通过建立MCAO模型并加以术后21 d的RIP干预,通过旷场实验和转棒实验检测大鼠的运动能力,并检测运动皮质BDNF的蛋白和信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)表达,并且从DNA 甲基化方向研究BDNF表达改变可能的机制,拟为RIP 的临床应用提供理论依据｡

1 材料与方法

1. 1 实验动物

50只健康无特定病原体成年雄性Sprague Dawley大鼠[来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,合格证号:SCXK(湘)2019-0004]建立MCAO模型时死亡2只,最终纳入实验48 只,体质量280 ~ 320 g｡所有大鼠分组前运用Longa5 评分确认为运动功能正常大鼠,即所有大鼠评分为0分,无神经功能损伤表现｡本实验方案经九江学院附属医院实验动物伦理委员会审批通过(伦理号:jjuhmer-b-2021-1102),所有操作符合动物实验伦理｡

1. 2 实验方法

应用MCAO 方法制备脑缺血-再灌注模型,将大鼠按照随机数字表法完全随机分为假手术组(Sham 组,16 只)､脑缺血-再灌注组(MCAO 组,16 只)和脑缺血-再灌注后远隔缺血后处理组(MCAO + RIP组,16只),各组中一半大鼠用于行为学实验､蛋白免疫印迹(Western blot)､实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)和点杂交实验,另一半用于免疫荧光实验｡应用MCAO方法制备脑缺血-再灌注模型大鼠,Sham 组大鼠仅手术分离出颈动脉,MCAO + RIP组大鼠于术后24 h进行双侧后肢根部弹力绳加压捆绑,以后肢远端皮肤发紫､皮温降低和脉搏消失为缺血标志,持续10 min,并松开10 min,连续3个回合,连续干预21 d｡

1. 3 脑缺血-再灌注MCAO模型制作

参照Longa5所用方法,将6%水合氯醛腹腔注射(0. 6 ml/ 100 g)麻醉大鼠,仰卧位固定,颈部备皮,碘伏消毒,颈部正中切口,钝性分离皮下脂肪和肌肉,尼龙线栓由左侧颈外动脉插入颈内动脉约20 mm,90 min后拔出尼龙线,缺血-再灌注｡大鼠术后清醒右侧肢体瘫痪,Longa5评分在1 ~ 3分为造模成功,其中1 分为悬吊大鼠尾部时,右前肢伸展障碍,2 分为行走时向右打圈,3 分为行走时向右侧倾倒｡

1. 4 旷场实验

MCAO术后第21 天,各组取8 只大鼠,共计24只｡旷场为黑色正方形底且面积1m2､高0.3m的装置,将大鼠放置于旷场中心随意运动5min,上方摄像机视频记录,并用ANY-maze软件(Stoelting,美国)对存储视频进行分析以获取运动速度和运动总距离等数据｡每只大鼠实验前,应用酒精擦拭旷场并保持旷场干净,排除大鼠气味等外界因素的干扰｡

1. 5 转棒实验

MCAO术后第22 天,设定20 r/ min 的转速,实验前对大鼠进行3 次转棒训练,正式实验时设定时间为5 min,记录大鼠在转棒上的停留时间,测试3 次后取转棒上的停留时间平均值作为该鼠的实验结果｡

1. 6 Western blot

MCAO术后第25 天,取各组 8 只共计24 只大鼠给予过量6%水合氯醛(1. 8 ml/ 100 g)腹腔注射处死,根据大鼠解剖图谱取运动皮质组织进行Western blot以检测各种相关蛋白质的表达量｡根据大鼠解剖图谱取大鼠新鲜的运动皮质组织,加入放射免疫沉淀法裂解缓冲液,经超声破碎后,4 ℃ 12 000 r/ min离心15 min(离心半径12 cm),吸取上清液｡二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒(ST2222,碧云天生物技术有限公司,中国)检测蛋白浓度并加入5 ×上样缓冲液(loading buffer)加热变性｡聚丙烯酰胺凝胶电泳:60 μg蛋白样本上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,冰上300 mA转膜2 h,10%脱脂牛奶封闭,TBST (QuickBlockTM封闭液与Tween配置而成,均来自碧云天生物技术有限公司,中国)洗3次,一抗孵育4 ℃冰箱过夜｡次日去除一抗,TBST洗膜｡荧光二抗室温孵育2 h,洗膜后用奥德赛扫膜仪扫膜｡一抗为抗β-肌动蛋白(β-actin,4970S,1∶ 1 000,CST,中国),抗BDNF(0071S,1∶ 1 000,CST,中国),抗TrkB(13129-1-AP,1∶3 000,Proteintech , 中国),抗神经元核抗原(neuronal nuclei, NeuN; 26975-1-AP, 1∶1000, Proteintech, 中国) ,抗含半胱氨酸的半胱氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase3; 9662S, 1∶ 1 000, CST,中国),抗α-微管蛋白(α-tubulin,2125S,1∶ 1 000,CST,中国),抗DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1;5032T,1∶ 1 000,CST,中国),抗DNMT3a(32578S,1∶ 1 000,CST,中国),抗DNMT3b(57868T,1 ∶ 1 000,CST,中国),抗5 甲基胞嘧啶羟化酶(ten-eleven translocation 1,TET1; 71128S,1 ∶ 1 000,CST,中国)｡二抗为马来酰亚胺(IRDye 800CW)羊抗鼠(1∶ 10 000,Abcam,中国)和IRD 680CW羊抗兔(1∶ 10 000,Abcam,中国)｡

1. 7 RT-qPCR

MCAO术后第25 天,取各组 8 只共计24 只大鼠进行RT-qPCR以检测大鼠运动皮质BDNF mRNA水平｡按照试剂盒(碧云天生物技术有限公司,中国)说明提取总RNA,测浓度后按照逆转录试剂盒合成互补DNA(complementary DNA,cDNA),并进行RT-qPCR 反应,RT-qPCR 采用SYBR-Green 荧光染料法,20 μl体系:SYBR荧光染料10 μl,cDNA 1 μl,上下游引物各8 μl,ROX 荧光染料0. 4 μl,无酶RNA水7 μl｡95 ℃预变性15 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s重复40循环,得出Ct值后采用2-△ △ Ct方法计算目的基因相对表达量并进行统计分析｡引物合成委托擎科生物科技有限公司(中国)合成,引物序列如下:BDNF-F TGGGTTACACGAAGGAAGGC; BDNF-R ATCCTTATGAACCGCCAGCC;Actin-F GATGACGATATCGCTGCGCTC;Actin-R GTCAGGATGCCTCTCTTGCT｡

1. 8 免疫荧光染色

MCAO术后第25 天,取各组 8 只共计24 只大鼠麻醉后经4%多聚甲醛(碧云天生物技术有限公司,P0099,中国)灌注固定后冰冻切片染色,将脑片用0. 2% PBS-Triton[磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)与免疫染色通透液(Triton X-100)配置而成,均来自碧云天生物技术有限公司,中国]打孔20 min,胎牛血清封闭1 h,抗NeuN抗体(1 ∶ 500,碧云天生物技术有限公司,中国)4 ℃冰箱过夜孵育,次日去除一抗,PBS漂洗3次,488标记的驴抗兔荧光二抗(1 ∶ 1 000,碧云天生物技术有限公司,中国)室温避光孵育2 h,去除二抗后PBS漂洗2次,含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(diamidino-phenylindole, DAPI)染色封片剂(碧云天生物技术有限公司,中国)封片,固定后在荧光倒置显微镜下观察大鼠运动皮质神经元阳性细胞数量,并进行拍照｡

1. 9 点杂交实验

MCAO术后第25 天,取各组 8 只共计24 只大鼠脑组织进行点杂交实验以检查各组大鼠运动皮质基因组 DNA 5 甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)甲基化修饰水平｡硝酸纤维素(nitrocellulose,NC)膜用20 ×柠檬酸钠盐酸缓冲液(saline sodium citrate buffer,SSC;碧云天生物技术有限公司,中国)处理后加载滤纸中于37 ℃烘30 min,将2 μl(100 ng)DNA点在NC膜毛面上,自然风干后烘箱120 ℃烘干30 min｡将膜用5%脱脂牛奶封闭1. 5 h,PBST(PBS-Tween 20,均来源于碧云天生物技术有限公司,中国)洗3 次,5mC 抗体(39649,1 ∶ 1 000, Protentech,中国)室温孵育2 h,PBST 洗3 次,二抗IRD 680CW羊抗兔(1∶ 10 000)室温孵育1 h,奥德赛扫膜仪(Licor,美国)扫膜｡

1. 10 甲基化特异性PCR

MCAO术后第25 天,取各组 8 只共计24 只大鼠脑组织进行甲基化特异性PCR 以检测各组大鼠运动皮质BDNF 的DNA 甲基化和未甲基化水平｡按照试剂盒(碧云天生物技术有限公司,中国)说明提取脑DNA,亚硫酸氢钠(NaHSO3;碧云天生物技术有限公司,中国)处理后进行PCR扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳和荧光化学成像仪进行分析｡靶基因的序列和引物如下,由擎科生物科技有限公司(中国)合成:U BDNF-F GATTTGAGTAGTTAAAGGAGTG;U BDNF-R AAATTCTTACATAATTCTAATAAATAAACA;M BDNF-F GATTTGAGTAGTGGGTAAAGGAGC;M BDNF-R TTACGTAATTCAATAAATAAACGAA;GAPDH-F ACAGCAACAGGGTGGTGGAC;GAPDH-R TTTGAGGGTGCAGCGAACTT｡

1. 11 统计学分析

使用Graphpad Prism 6 进行数据处理和作图,通过Shapiro-Wilk 检验对计量资料进行正态性分析,符合正态分布的计量资料以x- ± s 表示,多组间数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用Tukey 法,以P < 0. 05 为差异具有统计学意义｡

2 结果

2. 1 RIP干预改善MCAO 大鼠运动功能障碍

采用旷场实验和转棒实验评估RIP对MCAO 大鼠运动功能损伤的改善作用｡术后24 h 通过Longa5评分发现,Sham 组较MCAO 组和MCAO + RIP 组分值低[0 分比(2. 38 ± 0. 52)分;0 分比(2. 50 ± 0. 54)分,均P < 0. 01)]｡在术后第21 天,与Sham 组大鼠比较,MCAO 组大鼠旷场实验运动速度降低,运动总距离减少,而MCAO + RIP 组大鼠旷场实验运动速度和运动总距离较MCAO 组大鼠增加,差异均有统计学意义(均P <0. 05)｡术后第22 天,转棒实验结果显示,与Sham 组大鼠比较,MCAO 组大鼠转棒停留时间减少,MCAO + RIP 组大鼠的转棒停留时间较MCAO 组大鼠增加,差异均有统计学意义(均P <0.05)｡见表1 和图1｡

2. 2 RIP 增加MCAO 大鼠运动皮质BDNF mRNA和蛋白表达水平

3 组间大鼠运动皮质BDNF mRNA 相对表达水平和BDNF､TrkB 蛋白相对表达水平差异均有统计学意义(总体F 值分别为18. 78､10. 13､9. 359,P 值分别为0. 001､0. 012､0. 014)｡与Sham组大鼠比较,MCAO 组大鼠运动皮质BDNF mRNA､DBNF蛋白和TrkB蛋白相对表达水平降低,差异均有统计学意义(均P < 0. 05)｡而与MCAO组大鼠比较,MCAO + RIP 组大鼠运动皮质BDNF mRNA､BDNF蛋白和TrkB蛋白相对表达水平均升高,差异均有统计学意义(均P < 0. 05)｡见图2｡

2. 3 RIP抑制MCAO大鼠皮质神经元凋亡

3组间大鼠运动皮质神经元数量和皮质NeuN蛋白､促凋亡蛋白Caspase3相对表达水平差异均有统计学意义(总体F值分别为118. 000､6. 590､19. 770,P值分别为< 0. 01､0. 031､0. 002)｡

免疫荧光染色结果显示,与Sham组大鼠比较,MCAO组大鼠运动皮质神经元数量显著减少[阳性细胞数:(19 ± 3)个/视野比(92 ± 6)个/视野,P < 0. 01],但MCAO + RIC组[阳性细胞数:(55 ± 8)个/视野]较MCAO组运动皮质神经元数量增多(P < 0. 01)｡Western blot结果显示,与Sham组比较,MCAO组大鼠运动皮质NeuN蛋白相对表达水平降低,促凋亡蛋白Caspase3相对表达水平升高,差异均有统计学意义(均P < 0. 05);与MCAO组比较,MCAO + RIP组大鼠运动皮质NeuN 蛋白相对表达水平升高,促凋亡蛋白Caspase3相对表达水平降低,差异均有统计学意义(均P < 0. 05),见图3｡

2. 4 RIP 调节MCAO 大鼠皮质5mC 修饰引起BDNF甲基化

3组间大鼠DNMT1､DNMT3b､DNMT3a 和DNA甲基化羟化酶TET1的相对表达水平差异均有统计学意义(总体F 值分别为28. 290､22. 920､0. 305､3. 026,P值分别为< 0. 01､< 0. 01､0. 748､0. 123)｡

Western blot 结果显示,与Sham 组大鼠比较,MCAO组大鼠DNMT1 和DNMT3b的表达水平升高(均P < 0. 01),DNMT3a和DNA甲基化羟化酶TET1的表达水平差异均无统计学意义(均P > 0. 05),而MCAO + RIP组大鼠DNMT1和DNMT3b的表达水平较MCAO组大鼠均降低(均P < 0. 05),DNMT3a表达水平差异无统计学意义(P > 0. 05),TET1 的表达水平有降低趋势,但差异无统计学意义(图4a ~4e)｡

点杂交实验结果显示,3 组间大鼠运动皮质的总体5mC 甲基化水平差异有统计学意义(F =52. 899,P = 0. 001)｡与Sham组大鼠比较,MCAO组大鼠运动皮质的总体5mC 甲基化水平升高,而MCAO + RIP组大鼠皮质5mC甲基化水平较MCAO组大鼠降低,差异均有统计学意义(均P < 0 05)｡见图4f,4g｡甲基化特异性PCR结果进一步显示,与Sham组大鼠比较,MCAO组大鼠皮质BDNF甲基化水平升高,而RIP 可以降低MCAO 大鼠皮质BDNF甲基化水平,差异均有统计学意义(均P <0.05)｡见图4h,4i｡

3 讨论

脑缺血-再灌注后损伤在病理学上主要表现为细胞间质纤维化､细胞溶解与凋亡､脂质沉积｡该病的发生机制尚不明确,涉及到过度炎性反应､氧自由基过度产生的损伤作用､细胞凋亡､细胞内钙超载､兴奋性氨基酸的细胞毒性作用等｡再灌注可以挽救大多数脑组织,恢复早期再灌注的治疗策略已被证明可以改变再灌注损伤的程度,但也可能引起额外的伤害,导致患者的神经功能受到影响,直接影响患者的预后｡RIP 被认为是机体预防和治疗缺血事件中强有力的内源性保护方法,并且有研究表明,RIP对脑缺血具有保护作用,可以用于保护卒中后的脑损伤｡由于RIP可以通过对肢体等部位进行干预,具有事后性和长时间的持续作用,具有较好的临床应用前景｡研究表明,脑缺血-再灌注后RIP可减轻再灌注损伤,其潜在机制涉及减少脑水肿和血-脑屏障渗漏､调节神经元凋亡等｡也有研究报道,RIP治疗促进卒中恢复过程中动脉生成和增加Notch信号活性,并且改善了局灶性脑缺血后恢复期的血管生成重构｡这些结果均表明,RIP对缺血-再灌注损伤具有神经保护作用｡

但是关于RIP调控BDNF表达的研究较少,为了探索RIP对BDNF的调控以及可能的机制,本研究采用21 d的RIP作用于MCAO大鼠,通过旷场实验和转棒实验发现,RIP干预可以增加MCAO大鼠旷场运动速度､运动总距离和转棒停留时间,证明了RIP对于大鼠脑缺血-再灌注引起的运动功能障碍有显著的改善作用｡已经有一些研究证明,BDNF /TrkB在MCAO模型中发挥保护神经元和减轻神经功能障碍的作用,针对大鼠运动功能障碍,本研究进一步对其大脑皮质相关蛋白表达进行检测,结果表明,RIP可以增加运动皮质BDNF以及TrkB的蛋白表达,减少皮质神经元的凋亡｡并且RIP干预可以使MCAO大鼠运动皮质NeuN蛋白表达水平升高,促凋亡蛋白Caspase3表达降低,具有神经保护作用｡有研究指出,BDNF下调活性氧物质参与对氧化应激的调节,从而对抗缺血-再灌注损伤;缺氧诱导因子1α / BDNF/ TrkB /环磷酸腺苷反应元件结合蛋白可能参与调节卒中后的神经可塑性调节｡而我们针对BDNF甲基化进行深入探讨发现,MCAO +RIP组大鼠DNMT1 和DNMT3b 的蛋白表达水平较MCAO组大鼠表达降低,并且皮质5mC甲基化水平和BDNF甲基化水平较MCAO 组大鼠降低｡因此RIP可能是通过调控DNMT1 和DNMT3b 的表达,降低BDNF的5mC甲基化修饰达到上调BDNF mRNA和蛋白表达的作用｡总之,本研究认为,RIP 对MCAO大鼠的神经保护作用可能与调节5mC 甲基化修饰提高运动皮质BDNF mRNA 和蛋白表达有关｡

尽管如此,本实验仍然存在一些缺陷｡我们观察到MCAO + RIP 组大鼠TET1 的表达水平较MCAO组有降低的趋势,但差异无统计学意义(P >0. 05)｡考虑到本实验中大鼠样本量较少,可能引起P值的偏差,因此不能排除TET1 参与RIP 对皮质BDNF的调节｡此外,我们只验证了通过RIP 可以降低MCAO 组大鼠皮质DNMT1 和DNMT3b 的表达,而并未进一步实验,如果采用抑制剂抑制DNMT1 和DNMT3b 的表达后再检测皮质总体5mC水平,可能使研究结论更加科学｡

综上所述,21 d RIP处理可以明显地改善MCAO大鼠的运功能力,并且通过调节5mC 甲基化修饰提高运动皮质BDNF mRNA 和蛋白表达水平,达到神经保护作用｡

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