导 读

液体活检是指利用人体体液作为标本来源检测获取肿瘤相关信息的技术 ，包括从血液中分析细胞外DNA（cfDNA），具有非侵入性、可重复性、标本易获取等特点，可用于疾病的诊断、监测及分子病理学分析。近年来，随着分子生物学检测技术及精准治疗和个体化治疗的迅速发展，液体活检已广泛应用于肿瘤学、产前检测、传染病和器官移植监测等诸多领域，但在许多重要的临床应用中仍需要更高的灵敏度。在肿瘤学中，改善循环肿瘤DNA（ctDNA）检测灵敏度的努力主要集中在体外测序和分析方法上，但由于体内ctDNA的稀缺、难以收集足够的血液样本进行分析，这一直局限了液体活检灵敏度的提高。

血液中cfDNA（和ctDNA）的含量由其释放及降解、清除等过程共同决定。在循环系统中，cfDNA经释放后很快便会因肝脏巨噬细胞的摄取、循环核酸酶的降解等被分解和清除。因此，科研人员设想能否像静脉注射造影剂改善临床影像学一样，在抽取血样前注射试剂将这些分解和清除机制暂时性地封闭，使样本中更多的cfDNA得以保留，这也为增强肿瘤学和其他领域中其他稀缺生物标志物的检测提供了灵感。

为解决上述难题，美国麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的研究人员合作在Science上发表了题为“Priming agents transiently reduce the clearance of cell-free DNA to improve liquid biopsies”的文章，报道了一种提高液体活检灵敏度的新方法。研究团队开发了两种不同类型的静脉注射试剂，即“启动剂（priming agents）”，其分别由作用于负责cfDNA清除细胞的纳米颗粒和保护cfDNA的DNA结合抗体组成；在采血前1到2小时将引导剂注射到患者体内，可暂时延缓体内cfDNA的清除过程，提高样本中ctDNA的含量。研究团队在患癌小鼠中对引导剂进行了验证，发现其能提高ctDNA水平，可将检测小肿瘤的灵敏度从不足10%提升至75%以上。综上，该方法不仅可以更早地诊断癌症，还能更灵敏地检测肿瘤突变以便指导治疗，并有助于改善对癌症复发的检测。

文章发表在Science

为开发在任何血液采集中使ctDNA回收增强的通用方法，研究团队提出了两种短暂延缓体内cfDNA清除的静脉引导剂（图1）。体内cfDNA清除的两种自然机制是被单核吞噬细胞系统（MPS）的肝脏驻留细胞摄取和被循环核酸酶降解。考虑到大多数cfDNA以纳米颗粒单核小体的形式与组蛋白结合进行循环，研究团队假设一个竞争性的纳米颗粒（如脂质体），能够被MPS细胞高效吞噬，从而减缓cfDNA的细胞清除。

作为另一种补充策略，研究团队还假设一个DNA结合剂，可直接保护cfDNA本身免受循环核酸酶的影响，并延长其在循环中的半衰期。为此，研究团队选择了单抗（MAbs）作为开发对象，因为其在循环中具有持久性、易于工程化等特点以及作为生物制药具有良好的安全性和有效性。

图1. 引导剂降低cfDNA的清除并提高ctDNA的回收。

为验证上述假设，即注射脂质体会抑制细胞对cfDNA的摄取，研究团队使用小鼠巨噬细胞系J774A.1设计了一个体外二维实验，分析了胆固醇（50mol%）与三种不同脂类（SPE, DSPG, DSPC）(50mol%）结合生成脂质体的性能（图2）。结果显示，基于SPE和DSPG的脂质体显著抑制了巨噬细胞对单核体的摄取，并呈剂量依赖性。这两种制剂带更多负电荷，与中性电荷颗粒相比，更容易与巨噬细胞发生相互作用。

通过SPE脂质体，研究团队证实在独立的巨噬细胞系RAW264中，其对单核体摄取的抑制也是剂量依赖的。此外，脂质体处理不影响细胞的生存能力，不会影响对抗感染的正常吞噬途径。研究团队还评估了基于SPE的脂质体能否会降低cfDNA在体内的清除。结果显示，通过摄取SPE纳米颗粒，MPS巨噬细胞可减弱对单核小体的摄取，并增加从血液样本中回收内源性cfDNA。

图2. SPE脂质体在体外抑制巨噬细胞对单核体的摄取，并通过在健康小鼠中减少清除来增加cfDNA的回收。

接下来，研究团队探究DNA结合单抗直接保护cfDNA的方法，检测了8种已知的小鼠抗DNA免疫球蛋白抗体，并选择了IgG2a mAb（35I9）用于后续的研究（图3）。进一步，研究团队对35I9进行了改造（aST3），消除了其与Fc-γ受体（FcγR）的结合，以增强其在循环中的持久性。结果显示，经改造后，aST3可与cfDNA良好结合保护其免受酶消化，并显着延迟双链DNA (dsDNA) 的清除，提高了血液中cfDNA的回收率。

图3. 抗体引导剂与cfDNA结合并减缓其在健康小鼠中的清除。

在健康小鼠中，脂质体和抗体引导剂均显示出能提高cfDNA的回收率，接下来研究团队探究了其是否可以使用肿瘤知情方法来增强基于ctDNA的肿瘤检测，并跟踪了1822个肿瘤特异性单核苷酸变异（SNVs），在肿瘤进展的不同阶段每周（共三周）收集一次血浆，每次在注射脂质体或PBS后一小时。结果显示，与PBS处理的小鼠相比，注射脂质体显著增加了血浆cfDNA浓度（7倍、14倍和28倍）和回收的突变分子数量，突变分子回收率在第三周达到最大提高（约60倍）。上述结果表明，纳米颗粒能够分析更多的肿瘤基因组，并提高基于ctDNA的测试的灵敏度，从而能够在临床前模型中检测较小的肿瘤。

图4. 脂质体引导剂改善ctDNA的回收，并在小鼠肺转移模型中实现对较小肿瘤的检测。

研究团队还探讨了在相同的肺转移移植模型中，抗体引导剂对以ctDNA为基础的肿瘤检测的影响，在肿瘤进展的单个时间点（2周）检测了一系列剂量的抗体引导剂（0.5至8 mg/kg aST3对照8 mg/kg的IgG2a），并在注射mAb后的两小时内采集血液（图5）。结果显示，与IgG2a对照相比，所有浓度的mAbs均显著提高了cfDNA的回收率；在0.5和4.0 mg/kg之间存在剂量依赖性，当剂量为4.0 mg/kg时，效果最好。

最后，研究团队在临床前小鼠模型中分析了两种引导剂对ctDNA检测灵敏度的影响。结果显示，经脂质体和抗体引导剂处理后，均可改善cfDNA检测及肿瘤分子分析灵敏度，并延长 cfDNA 的半衰期，能够在临床前模型中检测到较小的肿瘤。此外，注射这两种引导剂的任意一种，血液中的DNA水平都会在大约24小时内恢复正常。综上，以上两种引导剂都将ctDNA的回收率提高了10倍以上，能够更好地从血液样本中获得完整肿瘤分子图谱；并显示出在癌症早期检测方面的应用前景，可将检测小肿瘤的灵敏度从10%提高到75%。

图5. 抗体引导剂可改善小鼠肺转移模型中的 ctDNA 回收。

综上所述，研究团队开发了用于液体活检的静脉引导剂，可提高样本中ctDNA的回收率。两种引导剂可在采血前1到2小时给予，以便在血样中恢复更多的cfDNA，使更多肿瘤基因组能够在一次采血中被检测到，并提高ctDNA检测的灵敏度。这一新策略不仅对提高液体活检的灵敏度至关重要，而且还为无创性癌症检测提供了新的可能性，但能否能进一步推广到临床上，还需更深入

参考文献：

CARMEN MARTIN-ALONSO, SHERVIN TABRIZI, KAN XIONG, et al. Priming agents transiently reduce the clearance of cell-free DNA to improve liquid biopsies. Science, 2024. doi.org/10.1126/science.adf2341

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