据世界卫生组织估计，全球有2.96亿慢性乙型肝炎(CHB)患者，每年有150万新发HBV感染者^[1]，我国有7 000万HBV感染者，其中有2 000万~3 000万CHB患者^[2]。每年全球约有70万人死于HBV慢性感染导致的肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌等并发症，造成了巨大的医疗和经济负担^[3]。据中华医学会肝病学分会《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》^[4]，抗病毒治疗可以有效抑制HBV的复制，从而减少肝脏炎症性坏死，降低肝硬化、肝细胞癌等肝病的发病率和致死率。

目前临床上常用的核苷酸类似物(NA)可有效降低血清病毒载量，但尽管长期治疗，仍很少实现功能性治愈，宿主免疫细胞抗病毒功能并未完全恢复，且共价闭合环状DNA(cccDNA)在肝细胞中持续存在，停药后仍会发生病毒学复发^[5]。HBV感染机体后，自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫反应的主要效应细胞，通过细胞毒性作用或产生细胞因子等发挥抗病毒作用，在慢性HBV感染期间，NK细胞功能受损，这可能有助于病毒的持久感染^[6]。免疫检查点是一类参与免疫系统负调节的免疫调节蛋白，主要包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3)、T淋巴细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、自然杀伤细胞2组成员A(NKG2A)等，这些免疫检查点特异性表达在T淋巴细胞、NK细胞等多种免疫细胞表面。近年来大量的研究表明免疫检查点参与了HBV感染的疾病发展过程，本文将从HBV病原学、慢性HBV感染机制以及常见免疫检查点在CHB中对NK细胞功能的影响等方面进行系统综述。

1HBV

1.1   HBV病原学及生命周期

HBV由包膜和核心颗粒组成，包膜是脂质双层膜，HBsAg嵌入其中，核心颗粒包含3.2 kb的松弛环状DNA(rcDNA)、HBcAg和病毒DNA聚合酶。其基因组由四个开放阅读框组成，负责编码蛋白。在感染开始时，HBsAg识别肝细胞上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，并以低亲和力结合，然后肝细胞表面的牛磺胆酸钠共转运多肽受体介导病毒进入宿主细胞，病毒包膜和肝细胞膜融合，并将核心颗粒释放到细胞质中，病毒核衣壳移除之后，病毒DNA进入肝细胞的细胞核，rcDNA经DNA修复形成cccDNA，其结构稳定，可以在宿主细胞中持续存在。cccDNA作为转录前基因组RNA以及其他信使RNA的模板，转录后输出到细胞质翻译成病毒蛋白，包括HBsAg、HBcAg、HBeAg、DNA聚合酶和乙型肝炎病毒X蛋白，核心蛋白可以构建成新的核衣壳，在核衣壳内，转录前基因组RNA在病毒DNA聚合酶的作用下逆转录成新的rcDNA，新的rcDNA可以进入肝细胞核补充cccDNA，也可以与内质网中的包膜蛋白聚集在一起进入分泌途径，从肝细胞排出到血液中^[7-9](图1)。

图1  HBV的生命周期

1.2   慢性HBV感染机制

慢性HBV感染的机制尚未完全阐明。在HBV感染中，先天性和适应性免疫反应是控制病毒感染和清除肝内炎症坏死的主要原因，但在慢性HBV感染患者中，宿主的免疫反应就像一把双刃剑，一方面可以破坏被感染的肝细胞来清除HBV，另一方面可以引起肝脏炎症，加重肝损伤，导致肝纤维化和肝细胞癌^[10-11]。Jin等^[12]分析了CHB患者外周血中各种免疫细胞亚群的百分比和功能等，发现CHB患者的外周血免疫细胞存在功能缺陷，尤其是NK细胞和T淋巴细胞。HBV可诱发宿主免疫细胞功能障碍，引起免疫失衡和功能缺陷，这可能是HBV感染慢性化的机制之一。

NK细胞是维持机体先天性免疫反应的主要细胞之一，通过识别和杀死靶细胞并分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子来发挥作用，根据NK细胞膜CD56的密度，NK细胞可以被分为两个亚群，CD56^bright和CD56^dim，CD56^bright NK细胞在受到刺激时产生大量的细胞因子，但细胞毒性较小，相反，CD56^dim NK细胞则通过脱颗粒功能杀死靶细胞，但分泌细胞因子的水平相对CD56^bright NK细胞较低^[13]。

已证实慢性HBV感染中T淋巴细胞功能衰竭是感染慢性化的重要机制，但越来越多的研究^[12, 14-17]发现，在慢性HBV感染中，NK细胞的功能也是衰竭的，主要表现为NK细胞的频数及分泌的细胞因子减少，但细胞毒性作用保持不变，这种现象被一些学者称为NK细胞的“功能二分法”，NK细胞的功能二分法有助于HBV的持续存在。NK细胞的功能受其表面激活或抑制性受体的调控，近年来，很多研究^[18-20]发现免疫检查点分子对慢性HBV感染中NK细胞功能也有重要的影响，在慢性HBV感染患者的NK细胞中，免疫检查点分子NKG2A、PD-1、TIM-3、TIGIT等的表达是上调的，致NK细胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力降低，并参与了肝细胞癌的进展。因此，了解免疫检查点对慢性HBV感染者NK细胞功能的影响至关重要。

2免疫检查点对慢性HBV感染者NK细胞功能的影响

2.1   NKG2A

NKG2A是C型凝集素超家族的成员，是一种单通道Ⅱ型跨膜糖蛋白，含有细胞外凝集素样结构域，跨膜结构域以及胞内段，细胞内部分有两个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，参与抑制性信号传导，NKG2A与CD94构成异二聚体，NKG2A/CD94的配体有非经典的MHC Ⅰ类分子、人白细胞抗原E^[21]。慢性HBV感染时，NK细胞上NKG2A的表达上调，Li等^[22]分析了活动性CHB患者、非活动性CHB患者和健康对照组的外周血NK细胞上的NKG2A水平，发现活动性CHB患者的NK细胞NKG2A阳性的百分比比非活动性CHB患者和健康对照组高，且NK细胞NKG2A的表达与血清病毒载量呈正相关，此外，HBV转基因小鼠NKG2A阳性的NK细胞也比对照组小鼠更高，阻断HBV携带小鼠的NKG2A信号可以降低HBV DNA、HBsAg和HBcAg水平。Ma等^[23]的研究同样发现CHB患者中表达抑制性受体NKG2A的NK细胞百分比增加，阻断NKG2A可以恢复NK细胞的功能，且慢性HBV感染期间，HBeAg可以诱导调节性T淋巴细胞中IL-10的产生，从而导致NKK2A在NK细胞上的表达增加，进而导致NK细胞的功能障碍。NKG2A/CD94与其配体结合后，NKK2A中的ITIM被Src家族激酶磷酸化，磷酸化的ITIM负责招募和激活含有SH2结构域的肌醇磷酸酶SHIP-1、SHIP-2以及酪氨酸磷酸酶SHP-1、SHP-2，这些酪氨酸磷酸酶能够通过去磷酸化作用抑制NK细胞激活受体产生的激活信号，最终引起NK细胞功能障碍^[21, 24]。

2.2   PD-1

PD-1于1992年被发现，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，含有单个细胞外IgV结构域、疏水性跨膜结构域和细胞质尾部结构域，其细胞质区域内含有ITIM样基序和免疫受体酪氨酸转换基序ITSM，PD-1的配体是PD-L1或PD-L2^[25-26]。Li等^[27]从慢性HBV感染者和健康个体的外周血中分离出外周血单个核细胞，用流式细胞术分析了PD-1在NK细胞上的表达，发现慢性HBV感染者NK细胞上PD-1的表达显著高于健康对照组。与李芬^[28]的研究结果一致，此外，慢性HBV感染者NK细胞的频数减少与其表面PD-1的表达上调相关。PD-1与配体结合后可以诱导NK细胞的衰竭，当PD-1与其配体结合后，除了ITIM样基序参与抑制性信号的传导外，ITSM结构域中的酪氨酸也会发生磷酸化并招募SHP-2，阻断磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和Ras激活，分别抑制PIP3-AKT-mTOR和MEK-ERK激酶途径传递的活化信号，从而抑制免疫细胞增殖、分化、存活和分泌细胞因子^[29]。阻断PD-1/PD-L1通路可以直接阻断抑制信号，改善NK细胞的功能和活性，也可以通过调控T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞来间接缓解NK细胞的功能抑制^[30]。慢性HBV感染者NK细胞表面PD-1的表达上调，导致NK细胞的功能衰竭，但具体的机制需要更多的研究来进一步说明。

2.3   TIM-3

TIM-3于2002年首次被发现，由氨基末端免疫球蛋白可变结构域、跨膜结构域和细胞质尾部组成，其细胞质尾部包含5个酪氨酸残基，与NKG2A和PD-1不同，TIM-3无ITIM样基序^[31]。TIM-3有四个配体，包括半乳糖凝集素9、癌胚抗原细胞黏附分子1、高迁移率族蛋白B1和磷脂酰丝氨酸^[32]。在慢性HBV感染中，TIM-3在许多免疫细胞中表达上调，如细胞毒性T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞和NK细胞等，TIM-3的表达上调常伴有上述免疫细胞的功能受损，而抑制TIM-3能部分恢复上述细胞的免疫功能，从而促进病毒的清除^[33]。Ju等^[34]采用流式细胞术检测CHB患者、健康对照组和脂肪性肝病患者外周血NK细胞中的TIM-3表达，发现与健康对照组和脂肪性肝病患者相比，CHB患者NK细胞中的TIM-3表达显著增加，并在被HBV载体转染的NK92细胞和HBV转基因小鼠肝脏分离的NK细胞中也检测到TIM-3表达增加，提示HBV感染可以上调NK细胞中的TIM-3表达；研究者还使用抗体阻断了CHB患者外周血NK细胞上TIM-3信号的传导，发现NK细胞的细胞毒性增加，分泌IFN-γ增多，认为TIM-3表达上调反过来可以抑制CHB患者NK细胞的功能，阻断TIM-3信号可以使NK细胞的功能恢复。目前，TIM-3导致慢性HBV感染NK细胞功能衰竭的机制尚未完全可知。有研究^[35-36]显示，TIM-3的配体磷脂酰丝氨酸与TIM-3结合可以抑制NK细胞的活化，磷脂酰丝氨酸促进了TIM-3酪氨酸残基的磷酸化，然后TIM-3与PI3K p110竞争性的结合p85，抑制下游的AKT-mTOR信号传导从而导致NK细胞功能衰竭。此外，HBV感染还可以增强肝细胞表面半乳糖凝集素9的表达，半乳糖凝集素9与NK细胞表达的TIM-3结合而抑制NK细胞的杀伤功能，减少IFN-γ的产生，并促使其发生凋亡，可能为HBV感染诱导肝脏NK细胞免疫耐受的机制之一^[37-38]。

2.4   TIGIT

TIGIT最早于2009年被确认为一种新型免疫检查点，TIGIT是CD28家族的一个新成员，可表达于几乎所有T淋巴细胞亚群及NK细胞表面，可以抑制T淋巴细胞和NK细胞的激活^[39]。TIGIT由位于细胞外的IgV结构域、单通道跨膜段、胞内段三部分组成，其胞内段除了ITIM样基序，还有免疫球蛋白酪氨酸尾样基序^[40-41]。TIGIT的配体主要包括CD155、CD112等，其中，CD155与TIGIT的亲和力最大^[42-43]。TIGIT与配体的相互作用可以导致免疫球蛋白酪氨酸尾样基序的磷酸化，并与生长因子受体结合蛋白2结合，招募SHIP-1抑制PI3K/MAPK信号传导，阻断核因子-κB的活化，进而抑制NK细胞的细胞毒性^[44-45]。Yu等^[20]使用流式细胞术分析了TIGIT和TIM-3在健康供体、CHB、HBV相关肝硬化和HBV相关肝细胞癌患者的表达，发现在HBV相关疾病中，TIGIT和TIM-3在NK细胞上的表达增高，TIGIT和TIM-3具有一定比例的共表达，且参与了NK细胞的功能衰竭。在HBV携带小鼠模型中，NK细胞上TIGIT的表达显著上调，阻断TIGIT后显著降低了小鼠模型血清HBsAg水平，且HBsAg转阴率增高，阻断TIGIT可以增加肝脏中NK细胞的数量并增强其分泌细胞因子的功能^[46]。

2.5   唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)-7/9

Siglec属于Ⅰ型凝集素家族的免疫调节性唾液酸结合受体，Siglec在多种免疫细胞上表达，大多数Siglec是抑制性受体，如Siglec-7、Siglec-9等。与NK细胞的抑制性受体NKG2A、PD-1等类似，Siglecs在其细胞质尾部也包含一个或多个ITIM样基序，与配体结合后，ITIM被Src家族激酶磷酸化，招募并激活酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2进而发挥抑制作用^[47]。在慢性HBV感染中，NK细胞Siglec-7的表达明显下调，HBV相关肝硬化患者的疾病进展与Siglec-7阳性NK细胞频数降低有关^[48]。Zhao等^[49]用流式细胞术评估了Siglec-9在慢性HBV感染者外周血NK细胞上的表达，发现HBV感染者Siglec-9阳性的NK细胞频数下降，且与病毒复制呈负相关，此外，阻断HBV感染患者NK细胞上的Siglec-9可增加NK细胞分泌IFN-γ、TNF-α和CD107a脱颗粒能力。虽然目前的研究证明Siglec-7/9参与了慢性HBV感染，但其对NK细胞功能的影响仍需要更多的实验研究来进一步阐明。

2.6   LAG-3

LAG-3于1990年被发现，是一种Ⅰ型跨膜蛋白。LAG-3主要作用是抑制T淋巴细胞的活化和增殖，同时抑制Treg的功能，LAG-3的结构与CD4具有同源性，通过与CD4竞争性结合人白细胞抗原Ⅱ类来抑制T淋巴细胞功能^[50]。虽然LAG-3也在活化的NK细胞上表达，但其对NK细胞的调控作用尚未得到明确^[47]。Narayanan等^[51]用流式细胞术评估IFN-α对健康供体外周血NK细胞的影响，发现暴露于IFN-α的NK细胞表面LAG-3的表达增加，使用抗体体外抑制NK细胞上的LAG-3信号后，细胞因子IFN-γ、TNF-α、MIP-1α和MIP-1β的分泌显著增加，但并不影响NK细胞的细胞毒性活性，因此他们认为LAG-3可能是成熟NK细胞的负调节因子，目前需要更多的研究来进一步明确LAG-3对NK细胞的作用。

在慢性HBV感染中，关于NK细胞的功能及其调节机制的研究结果仍然存在争议，Wang等^[52]认为HBV的持续感染和导致肝损伤的原因可能是由于NK细胞的过度反应，包括分泌的促炎细胞因子增多和细胞毒性增加，而免疫检查点与其配体结合抑制NK细胞的功能则可作为保护慢性HBV感染者免受严重肝损伤治疗的新靶点。因此，需要进行更多的研究来探索NK细胞功能在慢性HBV感染中的作用以及其功能失调的机制。

3小结与展望

为治疗慢性HBV感染，目前临床上所使用的药物主要为NA和IFN-α。NA是阻断DNA合成的直接抗病毒药物，可有效降低HBV DNA；IFN-α则通过多种机制产生抗病毒作用，包括直接抑制受感染细胞中的RNA和蛋白质的产生，并通过阻断核衣壳的组装来抑制HBV DNA复制，还可以激活NK细胞和靶向HBV感染的T淋巴细胞，因此，在极少部分患者中，IFN-α治疗可治愈感染，但相比之下，NA仅能抑制HBV基因组复制，对免疫反应或cccDNA的持续存在影响很小，并不能治愈感染^[53]。为完成世界卫生组织提出的2030年前实现全球肝炎消除的目标，许多研究者一直在探索治疗CHB的新方案，免疫治疗也成为治疗CHB探索的一个新方向。Envafolimab(ASC22)是一种皮下注射的针对PD-L1的单克隆抗体，在我国，ASC22正在开发用于治疗CHB和各种实体瘤^[54-55]。虽然目前慢性HBV感染者免疫功能调节的机制尚未完全阐释清楚，但是伴随着免疫检查点在慢性HBV感染中的研究深入，将为临床治疗提供更多的实验数据和理论支持，终将迎来更多能有效治疗慢性HBV感染的药物。

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黄俊, 邵慧娟, 马学锋, 等. 免疫检查点对慢性HBV感染者自然杀伤细胞功能的影响[J]. 临床肝胆病杂志, 2023, 39(8): 1932-1938

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