中文摘要

病毒检测在病毒感染的预防、诊断、治疗及病毒性疫苗的质量控制等方面发挥着重要的作用。实时荧光定量PCR通过荧光信号实时检测目的基因扩增数量，是目前实验室最常用的的病毒检测技术，具有灵敏度高、检测快速、污染小等优点。此文对实时荧光定量PCR技术在病毒感染的快速诊断、病毒核酸定量检测和病毒型别的鉴定三个方面的应用进行阐述。

正文

病毒感染常对机体产生不同程度的损伤或导致病毒性疾病，严重影响机体健康，因此病毒感染的检测十分必要。常用的病毒检测方法包括分离培养法、抗原抗体检测技术及实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR）技术等。其中qPCR技术是目前分子水平检测核酸的常用方法[1]，具有灵敏度高、特异性好、可多位点组合和单管多重检测等特点，在病原体的快速诊断、治疗效果的监测和评估、发现传染源、疾病流行暴发的处置以及病毒性疫苗的质量控制等方面得到了广泛应用。本文针对qPCR技术在病毒感染的快速诊断、病毒核酸载量的检测和病毒基因型别及突变株的鉴定等方面的应用研究进行综述。

1

qPCR技术

qPCR反应体系中加入了荧光化学物质，随着PCR反应过程中扩增产物的不断积累，荧光信号强度也等比例增加，通过荧光信号的变化实时监测整个PCR反应进程，将结果绘制成荧光扩增曲线图，从而定量定性分析起始模板。qPCR技术包括嵌入荧光染料法和荧光探针法[2]。常用的荧光染料包含嵌合型不饱和荧光染料SYBR GreenⅠ和饱和荧光染料ResoLight、Eva Green等，其中饱和荧光染料适用于高分辨率熔解曲线的分析[3]。常用的荧光探针包括TaqMan荧光探针、TaqMan MGB探针、锁核酸（locked nucleotide acid,LNA）探针等。相比荧光染料法，荧光探针法具有更好的特异性，能实现多重检测。

2

病毒感染的快速诊断

qPCR技术在病毒快速检测中具有开发速度快、灵敏度高、特异性好等特点，适用于新发传染病的快速筛查和诊断、对早期症状不明显的病毒传染病进行检测以及对具有相似病症的多种病毒感染的诊断等。

2.1

新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)

2019-nCoV感染可导致人体出现发热、乏力、干咳、呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征及多器官功能障碍[4]。2020年1月26日，国家药品监督管理局应急批准了首批3个采用qPCR技术进行核酸检测的试剂盒，截至2021年4月12日已有19个同类产品被批准使用。qPCR技术检测靶标主要针对2019-nCoV的开放阅读框（ORF）1ab、核衣壳蛋白（N）基因、刺突蛋白（S）基因、RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）基因以及包膜蛋白（E）基因[5]。Corman等[6]设计了针对RdRp特异性的探针，采用qPCR技术检测区分2019-nCoV与SARS冠状病毒（SARS coronavirus，SARS-CoV）。Lu等[7]针对2019-nCoV病毒ORF1a保守区设计特异性引物和探针，开发了qPCR分子诊断法辅助对病毒的鉴定和定量。Chan等[8]设计了3种针对RdRp/解旋酶（helicase，Hel）、S和N基因的qPCR法，并与基于RdRp-探针2（RdRp-P2）的qPCR法进行比较，发现RdRp/Hel qPCR法检测限较低，可达每毫升1.8半数组织培养物感染量（50%tissue culture infectious dose,TCID50)病毒样品或11.2拷贝/反应。采用以上两种方法共同检测273份临床样品，RdRp/Hel qPCR法可检出42份RdRp-P2 qPCR法阴性的样品，检测灵敏度提高了15.4%，且不与细胞培养物和临床样本中的其他冠状病毒发生交叉反应，灵敏度和特异性均很好。王月等[9]建立了针对N和ORF1ab基因的qPCR方法并进行了系统性验证，结果表明该方法具有良好的专属性，对20份COVID-19康复者恢复期血浆的核酸检测结果均为阴性，为恢复期血浆疗法提供了安全性保障。

2.2

新型布尼亚病毒

新型布尼亚病毒感染属急性起病，患者无明显临床症状，因此病毒感染早期难以确诊。采用针对新型布尼亚病毒S、M、L基因保守区的qPCR法,可以在发病2周内从患者血清中检测到病毒核酸[10]。采用qPCR、ELISA和胶体金免疫层析法检测86份新型布尼亚病毒感染患者血清样本，qPCR法的检出率为91.86%，而另两者的检出率低于50%[11]。Zhang等[12]开发了无需抽提核酸的qPCR方法检测873份新型布尼亚病毒感染患者临床样本，结果表明以常规qPCR法检测结果为标准，该方法的敏感性和特异性分别为91.1%和92.6%，检测总用时为1.5~2.0 h。该方法无需抽取核酸，对操作人员的技术要求也较低，适宜农村等偏远地区。

2.3

尼帕病毒

尼帕病毒是一种高致病性人畜共患病原体，感染早期常表现为发热性脑炎或肺炎，难以与其他发热性疾病区分开，检测病毒核酸能够对潜伏期病毒感染提供快速诊断[13]。但由于尼帕病毒发生变异，导致早期设计的某些qPCR检测方法可能会出现漏检。为此，王浩等[14]针对最为保守的N基因设计引物和探针，建立了基于TaqMan探针的qPCR方法，检测下限为100拷贝/μl，可检测野生型马来西亚株和孟加拉株样本的病毒核酸，且与其他副黏病毒核酸无交叉反应。

2.4

呼吸道病毒

多种呼吸道病毒（如流感病毒和呼吸道合胞病毒）感染可导致婴幼儿喘息，引起毛细支气管炎、喘息性支气管炎、支气管哮喘等多种喘息性疾病。临床上常用免疫荧光法检测鼻咽拭子中的病原体，操作繁琐且难以实现多重检测。王琪等[15]针对甲型流感病毒M基因、乙型流感NSⅠ基因和鼻病毒的5′非编码区，建立了能同时检测这3种易感病毒的Eva Green多重qPCR-熔解曲线法。由于3种病毒的熔解温度（melting temperature,Tm）范围不重合，因此可通过Tm值直接区分3种病毒。对100份临床样本的检测结果表明，该方法的检测效能均在95%以上。Ho等[16]采用基于qPCR技术的Xpert Xpress设备检测流感病毒和呼吸道合胞病毒，可实现从RNA提取到qPCR检测的全自动操作。与实验室的三重qPCR技术比较，检测20份质控品的符合率均为100%；采用两种方法对172份临床呼吸道样品进行检测，甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和阴性结果的总符合率分别为100.0%、100.0%、96.7%和99.7%。

3

病毒的核酸定量检测

病毒的定量检测常用于对病毒感染的病程监测，通过检测核酸载量辅助判断病毒复制的动力学和感染周期，指导临床治疗方向和药物疗效。利用qPCR技术对感染性病毒核酸进行定量，可检测病毒类生物制品的病毒滴度，相比传统方法更快速且操作简便，还易于快速检测多联多价疫苗。

3.1

血液中的病毒核酸定量检测

检测血液样本中的病毒载量，对诊断和监测抗病毒治疗的病毒学应答和耐药性必不可少。一种采用qPCR法从5μl血清或血浆样本裂解物中直接检测HBV DNA的试剂盒检测下限为377.47 IU/ml，特异性为100%。对87份HBV阳性样本定量检测结果与对照试剂盒具有良好的相关性[17]。该试剂盒操作简便、需要样本量少、成本较低，适用于HBV感染的诊断和用药效果监测。Wlassow等[18]采用基于qPCR法的GeneXpert全自动分析平台定量检测HCV RNA，与临床常用的试剂盒进行平行比较，对120份含HCV的6个基因型的感染者血清样本进行了定量检测，结果显示两者具有良好的相关性。GeneXpert也适用于全血干血斑样本，而且HCV基因型对检测结果无影响，全部实验过程仅需105 min，实现了对HCV RNA的自动化、快速、准确定量。

3.2

疫苗的病毒定量检测

病毒性疫苗的病毒滴度常规检测方法操作繁杂、耗时长、结果判读偏主观、检测通量低，检测多联/多价疫苗时还需要预先用抗血清进行中和。近欧洲药典[19]已将此技术纳入口服轮状病毒疫苗的滴度检定。刘悦越等[20]针对三价轮状病毒疫苗的G2、G3和G4型病毒的VP7基因设计探针，建立了基于细胞感染的qPCR法。对疫苗原液进行检测，各型回收率在97%～108%，与常规方法联合酶联免疫法的测定结果接近，具有较好的准确性。杜加亮等[21]针对G1、G2、G3、G4、G9型轮状病毒重配株的VP7基因设计引物探针，建立了各血清型减毒株的效价滴定qPCR法，各型别之间无交叉反应，对其他肠道病毒无特异性扩增。常规检测法的实验时间长达1~2周，还需要型特异性抗体来区分不同型的病毒。而基于细胞感染的qPCR法，在病毒感染细胞后18~24 h,即可收获样品进行检测，大大缩短了检测周期，而且具有良好的型别特异性，无需对样品进行前处理。Manukyan等[22]建立了在一个反应中同时定量检测三价口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（oral poliovirus vaccine，OPV）病毒滴度的多重qPCR法，对只含单型OPV Sabin株的样品或含有3种型别病毒的混合样品进行滴定，检测结果与传统方法一致。对单个型别检测时，两种方法的最低检测限相同。多重qPCR法解决了传统方法无法一次滴定多个血清型病毒的缺点，且将检测时间从传统方法的7~10 d缩短至2~3 d。该方法还可检测粪便样品，适用于临床研究中的排毒水平和环境监测中的病毒滴度检测。

4

病毒型别鉴定

利用qPCR技术，针对病毒特异性位点或可变区设计引物探针，可快速检测病毒株的分子特征，实现病毒型别的鉴定、疫苗株与野毒株的鉴别等，在流行病学调查、疫苗安全性监测等方面发挥作用。

4.1

水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）

水痘减毒活疫苗是人体预防VZV感染的有效手段，但偶有疫苗接种者会发生水痘或出现水痘样皮疹[23]。Ihira[24]等建立了针对VZV ORF62的基于循环探针的qPCR法，可用于高通量鉴别VZV野生株和Oka疫苗株。针对野生株和疫苗株的探针均具有良好的特异性，最低检测限为10拷贝。以环介导等温扩增-限制性酶切片段长度多态性检测法为标准，对38份疑似水痘或带状疱疹患者的拭子样本进行检测时，该循环探针qPCR方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为92.0%、75.0%、88.5%和81.5%，可以较好地区分临床样品中的野生株和疫苗株。

4.2

黄热病毒（yellow fever virus,YFV）

黄热病减毒活疫苗由YFV疫苗株17D制备而成。由于YFV17D与野生株序列存在保守性，早期的qPCR法无法区分两者。Hughes等[25]发现YFV 17D基因组有独有的8个特异性位点，可区别于其他谱系的YFV基因组序列。针对其中1个位点设计的LNA探针qPCR法具有较高的反应效率和特异性，对RNA质控样品的检出限为6.20拷贝，对添加YVF 17D的血清样品检出限为10.12拷贝。采用该方法检测1个疫苗相关临床分离株呈阳性反应，检测7个疫苗不良反应相关临床血清和组织样本均为YFV 17D RNA阳性，但与野生型YFV及寨卡病毒、登革病毒1－4型等其他病毒均无交叉反应。这是首个关于采用qPCR法区分YFV 17D疫苗株与南美和非洲谱系野生型YFV株的报道。

4.3

麻疹病毒

根据N基因序列可将麻疹病毒分为24个基因型，现有麻疹疫苗的生产毒株均属于A型，且A型野生株已不再流行。Roy等[26]对31株Edmonston疫苗株和其他疫苗株（沪-191、CAM-70、Schwarz FF-8和Edmonston AIK-C株）的序列进行分析，针对Edmonston株N基因478—548片段的保守序列设计引物和探针，建立了A型特异性LNA探针qPCR法，以快速区分野生株和疫苗株。采用该方法对88份A型样本、96份非疫苗型样本和其他基因型分离株进行检测，结果表明其敏感性为97%，特异性为100%。加拿大国家微生物实验室、德国Robert Koch研究所和美国疾病控制中心分别对上述方法进行了测试，总体敏感性为94%，特异性为99%。

4.4

流感病毒

流感病毒在传播过程中易发生突变，导致病毒产生不同的抗原性，监控病毒突变体有助于了解病毒在不同地区的流行情况并指导疫苗株的选择。Shu等[27]在流感病毒B/Victoria谱系变异病毒的研究中，针对HA基因发生K162N163、K162N163D164缺失突变以及未突变的区域设计3条特异性LNA探针，建立了qPCR检测法。3条探针的检出限分别为每毫升101.5、10-0.2和100.3半数感染量，相当于每个反应5～50个拷贝RNA。该方法在流感病毒B/Victoria谱系的3种突变株之间没有交叉反应，用B/Yamagata谱系和多种A型流感病毒株测试也均无交叉反应。

4.5

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV)

HPV有100余种型别，依据不同型别的HPV与肿瘤发生的危险性高低，分为低危型和高危型HPV。高危型HPV尤其是HPV16和18型，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的发生相关，，已作为筛查早期宫颈癌的重要标志应用于临床。Cobas 4800 HPV检测法采用针对病毒L1区的探针多重qPCR技术，同时检测高危型HPV16、HPV18和其他12种高危型HPV（HPV31/33/39//45/51/52/56/58/59/66/68），检测用时1 d，不同型别HPV的检测灵敏度在150～2 400拷贝/ml。Cobas 4800检测法的灵敏度与第二代杂交俘获法相当；由于降低了与低危型HPV基因型的交叉反应，特异性得到改善[28]。

5

展望

qPCR技术作为第二代PCR，是目前最常用的核酸检测技术，以其较高的灵敏度、特异性及设计的简便性，被各类高通量实验室广泛应用。随着检测技术的日益更新、材料和设备的持续优化，不断涌现新的技术方法与平台。例如，将微滴化或微流控技术与qPCR技术相结合的第三代PCR技术—数字PCR，无需外部标准品即可实现核酸分子的精确定量，被用于qPCR技术标准品的测定[29]；对于病毒载量较低的样品，数字PCR具有更高的灵敏度[11,30]。探索高效、准确的不同类型样品核酸抽提技术和不断优化检测平台，有助于开发低成本、高通量、标准统一的自动化检测方案，助力疾病的诊断、预防与控制。

来源：国际生物制品学杂志,生物制品圈

注：文章内的所有配图皆为网络转载图片，侵权即删！

Tags： 荧光定量PCR技术检测病毒的应用一览