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体外（Ex vivo）工程嵌合抗原受体 (CAR)T 细胞治疗改变了某些血液恶性肿瘤的治疗，但制造复杂性和有限的患者可及性限制了其影响。体内（in vivo） CAR T 细胞工程试图通过在个体内直接生成 CAR T 细胞来克服这些限制。

《nature cancer》近日发表文文章， 阐述了肿瘤学中快速发展的体内 CAR T 细胞生成领域，概述了淋巴细胞靶向原理，讨论了药理学和生物分布，并评估了新出现的安全性问题。最后还提出了转化方面的观点，重点介绍了机遇以及将决定临床实施路径的悬而未决的问题。

过继性细胞疗法包括肿瘤浸润淋巴细胞、T细胞抗原受体（TCR）修饰的T细胞和嵌合抗原受体（CAR）T细胞，已经改变了癌症的治疗格局。在一些血液系统恶性肿瘤中，体外工程化的CAR T细胞在B细胞癌症中取得了深度而持久的反应，部分个体观察到长期疾病控制。然而，这些成功依赖于一个复杂的集中式生产流程，该流程成本高昂、物流要求高，并且对于部分患有快速进展性疾病的患者而言速度太慢。

这些局限性推动了对体内CAR技术的兴趣激增，该技术将编码CAR的载荷或预制CAR蛋白直接递送至内源性T细胞，在体内原位编程，从而绕过传统的细胞生产。从概念上讲，体内方法可能将CAR疗法从细胞产品转变为即用型治疗，缩短治疗时间线，并扩大患有侵袭性或晚期恶性肿瘤个体的可及性。

目前处于积极开发阶段的主要平台包括：（1）非整合性非病毒系统，包括纳米载体中的mRNA/环状RNA（circRNA），可实现快速但瞬时的表达；（2）整合性非病毒系统，包括带有瞬时转座酶的小环DNA，支持持久表达；（3）整合性病毒系统，包括慢病毒载体（LVV），可提供稳定的基因组插入和潜在的长期持久性；（4）非整合性病毒系统，包括腺相关病毒（AAV）载体，允许游体外递送，实现短期至中期表达并降低插入突变风险（图1和表1）。早期的临床前和首次人体研究证实了使用这些方法在体内编程T细胞的可行性，且每种方法都具有独特的药代动力学、整合谱和安全性特征。

本Perspective文章考察了体内CAR方法在肿瘤学领域的技术进展和转化挑战，比较了主要的递送策略，概述了淋巴细胞向性、表达动力学和持久性的关键决定因素，并讨论了新兴的药理学和临床转化安全性框架。

体外与体内CAR工程比较

体外CAR T细胞疗法涉及从患者或供者分离T细胞，在体外进行基因工程改造，在受控的生产条件下扩增，然后将最终的工程化细胞产品回输给个体。该策略支撑了目前获批的CAR T细胞疗法的临床成功，但仍然复杂、昂贵且耗时，并且所需的体外激活和扩增可能改变T细胞表型和功能适应性。相比之下，体内CAR T细胞工程在其天然微环境中直接修饰T细胞，可能保留较少分化的状态，包括初始或干细胞记忆T细胞。对于旨在支持持久CAR表达的体内CAR平台，可以改善体内扩增、持久性和长期记忆形成。此外，基于mRNA的体内CAR策略介导快速但瞬时的CAR表达，使其适用于优先考虑可控性和安全性的应用，例如新型抗原靶点的低风险评估以及急性或时间限制性疾病背景的治疗。

非整合性非病毒系统

在新兴平台中，mRNA脂质纳米颗粒（LNP）系统能够将编码CAR的mRNA非病毒递送至内源性T细胞（图1a）。这会产生快速但瞬时的CAR表达，这可能减少与CAR T细胞活性延长相关的毒性。由于mRNA在细胞质中发挥作用且不整合到基因组中，它也避免了与整合性病毒载体相关的插入突变风险。为了提高T细胞特异性，大多数研究使用抗体或纳米抗体修饰的靶向LNP（tLNP），这些抗体或纳米抗体针对T细胞抗原，如CD3、CD5、CD7和CD8。

近年来，tLNP设计和mRNA工程的进展提高了递送特异性、效力和治疗活性。早期的概念验证研究表明，递送成纤维细胞活化蛋白CAR mRNA的CD5-tLNP在小鼠脾T细胞中诱导了约20%的瞬时CAR表达，将T细胞重定向至活化的成纤维细胞，减少了心脏纤维化并改善了心脏功能。随后的优化减少了脱靶肝脏递送并改善了T细胞定向的mRNA摄取。使用该平台，递送优化抗CD19 CAR mRNA的CD8-tLNP增强了CAR表达和功能，在白血病异种移植模型中实现了近乎完全的清除。在食蟹猴中，递送抗CD20 CAR mRNA的CD8-tLNP诱导了深度但可逆的外周和组织B细胞耗竭，与瞬时CAR活性一致。还使用肽-MHC功能化的LNP实现了抗原特异性摄取，这使得能够在流感病毒特异性T细胞中进行体内抗B细胞成熟抗原（抗BCMA）CAR工程，并在多发性骨髓瘤小鼠模型中实现持久的肿瘤消退。

尽管取得了这些进展，但经过同行评审的临床数据仍然有限，也突显了该领域的新兴地位。最清晰的临床证据来自HN2301，这是一种携带抗CD19 CAR mRNA的CD8-tLNP，已在五名难治性系统性红斑狼疮患者中进行了评估。单次静脉输注显示了瞬时的、靶向的药理学作用，但未确定持久疗效。在肿瘤学领域，CAR mRNA的临床测试也正在进行中，包括在上皮性肿瘤和肝细胞癌中的TROP2-和GPC3-CAR方法。这些研究支持体内CAR表达的可行性，但可能需要重复给药或持久性增强策略来维持持续的治疗活性。

除了线性mRNA，circRNA作为LNP介导的CAR编程的有前景的载荷也正在兴起，因为其共价闭合结构可以增加对外切核酸酶降解的抵抗力并延长蛋白质表达。使用LNP递送的CAR circRNA的临床前研究已在免疫细胞亚群（包括T细胞、自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞）中显示出快速且持久的CAR表达，以及在HER2肿瘤模型和炎症性疾病模型中的抗肿瘤功效。然而基于circRNA的平台仍不如线性mRNA成熟。关键挑战包括标准化生产、质量控制以及依赖于背景的非帽依赖性翻译，这可能使对蛋白质表达和剂量-反应关系的控制复杂化。目前，线性mRNA/LNP仍是临床上更成熟和可预测的平台，而circRNA可能更适合需要以较低剂量持续表达蛋白质以改善治疗窗的情况。

与基于核酸的策略不同，无基因的体内CAR方法递送CAR蛋白本身。携带预制抗CD19 CAR蛋白的病毒模拟融合纳米囊泡（FuNV）已在淋巴瘤小鼠模型中进行测试，它们通过靶向T细胞的融合蛋白（携带抗CD3单链可变片段（scFv）的工程化病毒融合蛋白，指导囊泡与T细胞融合）直接与T细胞融合，并诱导快速但瞬时的CAR展示，从而减缓了B细胞淋巴瘤的生长，没有产生细胞因子释放样信号或血液毒性。然而由于CAR是作为膜蛋白而非转移基因编码的蛋白质递送的，因此CAR T细胞表现为瞬时CAR展示而非扩增。重复给药耐受性良好，随后的一项类风湿关节炎研究进一步支持了该策略用于B细胞耗竭。尽管峰值CAR水平和持久性仍然有限，但FuNV为瞬时CAR递送提供了一条互补的基于蛋白质的途径，且具有有利的安全性特征。

总之，这些研究确定了非整合性CAR平台的关键设计变量，包括载荷形式、靶向配体、偶联化学和CAR抗原选择（图2）。尽管这些方法可以提供有利的安全性特征，但它们并非设计用于生成长寿的CAR T细胞，并且存在重要的局限性。重复给药可能引发针对递送成分的免疫反应，限制持久性和重新设计的可能性。巨噬细胞（尤其是肝脏Kupffer细胞）的脱靶摄取也可能将载荷从靶细胞分流。

整合性非病毒系统

LNP技术已经超越了简单的mRNA递送。将CAR载荷与互补分子共同递送，原则上可以改善持久性和CAR T细胞功能（图1b）。这一概念已扩展到使用NCtx（一种抗CD7/CD3-tLNP平台）进行整合性非病毒CAR递送，该平台共同递送编码CAR构建体的小环DNA和SB100x转座酶。小环DNA是一种最小化的质粒衍生物，排除了细菌骨架序列，支持更高效和持续的转基因表达，而在靶细胞中瞬时表达的SB100x转座酶mRNA，可介导CAR稳定基因组整合到T细胞基因组中。NCtx递送的双特异性CD19/CD22-CAR生成了持久的CAR T细胞，并在人源化小鼠中介导了完全的肿瘤消除，首次证明了使用整合性非病毒LNP系统在体内生成了稳定、功能性CAR T细胞。与mRNA/LNP平台相比，该策略起效较慢但持久性更强，可能适合那些优先考虑长期持久性而非即时细胞减灭的适应症。

可编程CRISPR递送包括抗体靶向的Cas9包膜递送载体（EDV），提供了体内CAR T细胞工程的另一条途径。尽管EDV来源于慢病毒颗粒，但它们是复制缺陷型、非整合性且可编程的载体，因此在功能上不同于传统的病毒载体。一项初步研究表明，共同展示scFv靶向部分的EDV能够选择性地将Cas9核糖核蛋白复合物和整合性CAR转基因递送至人源化小鼠中的人T细胞。与靶向T细胞的慢病毒相比，Cas9 EDV产生的峰值CAR T细胞水平较低，且CD19+ B细胞耗竭可变，但基因组编辑富集在CAR T细胞亚群中，支持耦合递送和编辑。克隆型分析显示存在多个独立的体内转导事件，而非单克隆扩增，并伴有令人鼓舞的早期安全性信号。最近，该策略已通过双EDV/AAV系统得到扩展，其中抗CD3靶向的EDV递送靶向TCRa恒定区（TRAC）的Cas9核糖核蛋白复合物，而工程化AAV提供CAR供体模板用于同源定向修复。与先前的研究不同，该设计将CAR特异性插入TRAC位点，而非半随机插入。该策略在B细胞急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤和肉瘤模型中实现了显著更高的CAR T细胞频率、完全的B细胞再生障碍和肿瘤控制，且无全身性炎性细胞因子释放。

整合性病毒系统

整合性病毒系统使用工程化病毒载体递送稳定整合到基因组中的CAR转基因，从而在体内T细胞转导后实现持久的CAR表达（图1d）。这种持久性可以延长治疗活性，但也对载体设计提出了严格要求，包括需要避免血清介导的（‘裸露’）慢病毒颗粒中和，并实现对预期免疫细胞亚群的特异性。当代的体内慢病毒载体（LVV）系统通过包膜选择或突变来去靶向天然向性，并使用病毒体展示的结合物（纳米抗体/scFv；图3a）将颗粒重靶向至T细胞，从而解决这一问题。大多数平台结合这些元素以实现T细胞选择性转导（表2）。

历史上，水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）成为LVV的默认假型（一种载体，其核心包装有另一种病毒的包膜以重靶向进入），因其支持广泛的低密度脂蛋白受体（LDLR）介导的向性、高功能滴度和稳健的生产。活化的T细胞对VSV-G介导的转导更具容许性，部分通过增加LDLR家族受体的结合和随后的内体融合。随着CAR T细胞生产在2000年代至2010年代从γ逆转录病毒转向慢病毒系统，VSV-G也成为根深蒂固的主力假型。然而，其广泛的向性是体内递送的主要限制，其中必须最小化脱靶摄取和整合。

该方法最先进的临床实例是ESO-T01，这是一种TCR靶向、CD47屏蔽的LVV，编码抗BCMA CAR。ESO-T01使用工程化的VSV-G衍生进入系统来减少天然的广泛向性，并通过抗TCR纳米抗体重定向载体摄取。在两个独立的早期阶段试验中，九名复发/难治性多发性骨髓瘤患者中有八名获得了客观缓解，包括五名严格完全缓解和三名部分缓解。这些早期临床结果令人鼓舞，尽管基于小队列且缺乏与体外BCMA-CAR T细胞产品的直接比较。安全性需要仔细审查：早期炎性毒性很常见，包括数名患者的≥3级细胞因子释放综合征，并且在CD3-淋巴细胞和NK细胞中检测到低水平CAR表达。这些发现既突显了体内LVV-CAR T细胞生成的前景，也表明需要进行更大规模的研究，并长期监测脱靶整合、插入突变和平台特异性毒性。

其他相关系统使用不同的去靶向和重靶向策略进行体内LVV递送。一种方法使用工程化的VSV-G衍生融合蛋白，实现LDLR非依赖性进入，而另一种使用cocal-G作为替代假型，以获得更高的血清抗性（图3b）。VSV-G衍生平台通过LVV包膜上的CD7结合scFv赋予CD7定向特异性，将载体摄取重定向至CD7+ T和NK细胞。静脉内递送后，该平台生成CD20-CAR T和CAR NK细胞，清除人源化小鼠中的CD20+ B细胞肿瘤，并耗竭食蟹猴中的B细胞。其在B细胞恶性肿瘤中的首次人体评估现已启动（表3）。第二种策略将cocal-G假型化与膜结合的多功能融合结构域相结合，该结构域通过CD3激活T细胞，并通过CD80-CD28和CD58-CD2相互作用提供共刺激。该平台在小鼠模型中生成了体内CAR T细胞和稳健的肿瘤控制，以及在灵长类动物中实现了B细胞再生障碍和记忆样反应。总之，这些研究表明整合性病毒系统如何通过不同但相关的解决方案进行工程化：血清抗性假型化、天然向性去靶向、免疫细胞重靶向，以及在某些情况下的内置T细胞激活。

尽管取得了这些进展（表3），VSV-G和cocal-G假型化载体仍部分受限于其天然受体生物学。VSV-G使用LDLR/LDLR家族受体，这些受体在静息T细胞上表达较差，而cocal-G假型化载体与VSV-G共享受体使用。尽管工程化的VSV-G变体可以减少天然向性并实现重靶向，但VSV-G和cocal-G各自使用单个糖蛋白来介导受体附着和膜融合。这使得在保持高效融合的同时去靶向天然受体结合在技术上具有挑战性，并存在脱靶转导和肝脏摄取的风险。

副粘病毒包膜提供了另一种解决方案，因为它们天然地分离了附着和融合功能。在尼帕病毒（NiV）中，附着糖蛋白可以被工程化以重靶向T细胞标志物，而融合蛋白则保留膜融合活性（图3b）。NiV是一个明智的选择，因为它天然地在果蝠中循环，仅偶尔传播给人类。目前，没有针对NiV的许可疫苗接种计划，因此预计人群中的中和抗体非常低。然而，NiV假型化载体通常需要包膜尾部截短和其他优化才能达到功能性滴度，这些滴度通常仍低于VSV-G假型化载体。使用抗CD3或抗CD8重靶向的临床前NiV-LVV平台已在体内生成了功能性CAR T细胞（包括来自非活化的人T细胞），诱导了快速的B细胞再生障碍，与VSV-G假型化载体相比提高了T细胞特异性，并且当与ephrin阻断的糖蛋白结合时减少了肝脏摄取。

甲病毒来源的包膜提供了另一种模块化重靶向策略。辛德毕斯病毒（SINV）包含功能上可分离的E1和E2蛋白，其中E1介导低pH内体融合，E2介导受体结合，允许通过E2重定向细胞靶向，同时保留融合功能。利用这一原理，一种桥接突变SINV E2与CD3的双特异性结合物实现了静脉注射后选择性的体内T细胞转导（图3b）。在人源化小鼠中，SINV假型化载体在血液中生成了可检测且持久的CAR T细胞，增加了CAR T细胞浸润并减少了脾脏中的CD19+肿瘤负荷，尽管CAR T细胞频率仍然较低。该策略提供了灵活性，因为靶向结合物原则上可以交换，以将载体重定向至不同的细胞群体，而无需重新工程化病毒糖蛋白。然而，抗癌活性仍然有限，并且由于该研究使用了预活化的外周血单核细胞，对未刺激T细胞的有效转导仍有待证明。需要进一步优化以提高效力和持久性。

总之，这些平台 (图3) 说明整合体内 CAR 系统的一个中心设计权衡：持久的 CAR 表达需要稳定的基因组整合，但这种益处必须与需要精确的免疫细胞靶向、低肝脏摄取、可控的免疫激活和长期遗传毒性监测进行平衡

非整合性病毒系统

AAV平台是探索用于体内CAR T细胞工程的最成熟的非整合性病毒平台。通过主要作为游体外递送遗传货物，AAV可以支持比mRNA/LNP系统更长时间的表达，同时避免与慢病毒或逆转录病毒载体相关的稳定基因组插入（图1c）。这使得AAV介导的CAR递送介于瞬时mRNA/LNP递送和持久LVV整合之间，具有中等的起效和持久性。

与包膜病毒不同，AAV不能被假型化。相反，其受体使用和生物分布可以通过将遗传货物包装到不同血清型的 capsids 中来改变。该策略已应用于体内CAR转导，使用AAV-DJ载体，这是一种通过八种野生型血清型的DNA改组产生的嵌合capsid。在人源化小鼠中，单次全身剂量的编码抗CD4 CAR的AAV-DJ在CD45+细胞上产生了可检测的CAR表达，减少了肿瘤负荷，并实现了与常规体外CAR T细胞相当的总生存期。未使用预处理或淋巴细胞清除。然而该策略仍依赖于capsid向性和特异性，增加了转导非T细胞或恶性细胞的风险。

尽管安全性和持久性前景良好，但目前的数据表明优先转导或持久存在于活化的T细胞中，并且其他研究记录了AAV的残留脱靶转导，这也突显了改进capsid工程和靶向特异性对于安全有效转化的必要性。AAV还受限于预先存在的免疫性（由于AAV中和抗体在全球的高血清阳性率）以及体内CAR频率不高。这些数据大多来自非癌症背景，因此在癌症模型中的严格评估对于确定其在预期环境中的治疗价值和安全性至关重要。

临床转化的挑战与考量

从转化的角度来看，体内CAR T细胞策略不太可能普遍适用于所有临床适应症。许多首创的体内CAR产品战略性地首次亮相于炎症性或退行性疾病，其中炎症会增加血管通透性和白细胞运输，可能改善载荷递送和工程化T细胞向疾病组织的移动。癌症则带来了一套不同的转化挑战。血液系统恶性肿瘤提供了一个实用的切入点，因为血液和骨髓中的恶性细胞易于接近，并且CD19和BCMA等靶点高度表达、谱系限制，且伴随可控的靶向、脱癌毒性。实体瘤仍然是最具挑战性的前沿。其异常的脉管系统和致密基质限制了T细胞浸润。抗原异质性进一步使靶向复杂化，而免疫抑制性肿瘤微环境施加了额外的限制。迄今为止，体外CAR疗法在实体癌中仅取得了有限的获益，且尚无成功的体内CAR临床实例报道。尽管整合性平台（如LVV）可能支持更持久的CAR表达，但体内生成的CAR T细胞是否能够达到足够的数量和持久性以控制肿瘤，特别是在肿瘤负荷大或经过大量预处理的个体中，仍不确定。因此，从体外到体内CAR T细胞的转变并不能从本质上克服限制CAR T细胞疗法在实体瘤中应用的生物学障碍。

除了疗效，安全性和免疫毒性仍然是核心的转化考量。与体外CAR T细胞疗法（其中细胞剂量、表型和产品组成可在输注前控制）不同，体内CAR平台直接递送遗传载荷和靶向试剂。这降低了对给药后生成的CAR工程细胞的数量、位置、表型和持久性的控制。这也带来了独特的风险，包括通过Toll样受体和STING信号通路等途径的先天免疫感应、全身性细胞因子血症、再给药挑战和脱靶递送。尽管体外CAR T细胞的毒性，包括细胞因子释放综合征、免疫效应细胞相关神经毒性综合征和插入突变，已被充分认识，并通过临床经验日益可控，但体内CAR平台的安全性框架尚不成熟。早期的临床研究尚未报告许多传统上与体外CAR T细胞疗法相关的严重毒性，但随访时间仍然较短，参与者人数较少。此外，尽管一些研究报告脱靶效应较低，但其他研究主要依赖于全身或整体组织读数，可能遗漏单细胞分辨率下的罕见脱靶CAR表达。

除了生物学和安全性考量外，生产也是体内CAR方法面临的主要转化挑战。病毒载体生产必须严格控制纯度和效力，因为异质的LVV制剂可能增加纯化挑战和免疫激活风险。对于mRNA/LNP平台，生产和配方与生物学性能密切相关。脂质组成、粒径和靶向配体的表面展示影响颗粒与T细胞结合、进入细胞和逃离内体的效率，从而影响效力、免疫原性和最终被编程的T细胞亚群。随着LNP被多重化以共同递送CAR与共刺激模块、细胞因子或持久性调节剂，这些变量将变得更加重要。尽管这种设计可以增强效力，但也将对生产精度、质量控制和监管审查提出更高要求。

重复给药的可行性在很大程度上取决于递送平台的设计。对于mRNA/LNP系统，重复给药是常用的，并且通常耐受性良好。然而，为提高纳米颗粒稳定性和循环时间而加入的聚乙二醇化脂质，可以诱导抗PEG抗体，从而降低后续给药的递送效率。可电离脂质作为LNP的核心功能成分，可以激活先天免疫通路，导致非预期的免疫反应和可能的毒性。对于整合性病毒载体，如LVV系统，通常旨在单次使用，对病毒成分的免疫反应预计会限制再给药。由于人群中常见血清型预先存在免疫力的高流行率，AAV平台在再给药方面面临额外限制。总的来说，这些考量表明在选择不同递送平台时需要仔细考虑免疫原性。

避免清淋化疗是体内CAR T细胞方法的一个关键临床优势，因为它可以简化治疗，减少与预处理相关的毒性，并扩大参与者的合格性。然而，清淋化疗也通过减少免疫竞争、增加稳态细胞因子、重编程肿瘤微环境和促进CAR T细胞扩增和持久性来支持常规体外CAR T细胞疗法。因此，尽管体内CAR生成通常可以在无预处理的情况下实现，但这可能限制在需要稳健扩增和持久持久性的情况下的疗效，特别是在实体瘤中，新生成的CAR T细胞必须在一个完整且通常是抑制性的免疫环境中发挥作用。

讨论与展望

体内CAR平台已成为高度适应性技术，能够直接编程内源性T细胞以对抗多种抗原，无需单采和体外细胞处理，具有降低治疗复杂性、降低毒性和扩大参与者合格性的潜力。在主要的递送类别中，临床前和早期临床数据令人鼓舞，但每个平台都具有独特的生物学和转化权衡。mRNA/LNP和AAV平台并非设计用于稳定基因组整合，这可能提供更有利的安全性特征，但瞬时或游体外CAR表达意味着它们不太可能生成自我更新的长期CAR T细胞库。相比之下，LVV平台可能通过基因组整合提供更强的持久性，但这伴随着额外的安全性考量，包括脱靶转导和插入突变。所有平台的人体数据仍然有限。实现持久疗效，特别是在实体瘤中，可能不仅需要高效的体内基因递送。它需要将平台设计与参与者的内源性T细胞状态仔细匹配、剂量优化以及整合持久性支持策略，如细胞因子补充、共刺激增强、审慎的检查点调节、抗原或疫苗加强以及促进记忆T细胞亚群。

体内递送在理论上具有接触初始和较少分化的T细胞同时绕过体外激活和扩增的优势，从而保留其增殖能力和长期持久性的潜力。然而在实践中，目前大多数递送平台在活化的T细胞中效率更高，因为活化增加了细胞摄取、转录和翻译。这为该领域创造了一个核心张力：最易于工程化的细胞可能并不总是最适合持久治疗功能的细胞。此外，许多靶向策略和递送载体诱导伴随的T细胞激活，例如，通过抗CD3结合，提供可以改变T细胞表型远离初始状态的刺激信号。同时，病毒载体和LNP都可以参与先天感应通路，可能驱动非特异性免疫激活并增加安全性问题。

尽管体内CAR策略可能降低每位患者的成本，但临床级别的tLNP和LVV生产仍然要求很高，而新兴模式如circRNA和CRISPR-Cas9方法增加了进一步的监管复杂性。递送平台、载荷设计和生产的持续创新对于使CAR T细胞疗法更易获得和适应性更强至关重要。

参考文献

Nat Cancer . 2026 Aug 21. doi: 10.1038/s43018-026-01216-0.

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