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由于靶向治疗的获批日益增多，晚期胆道癌（aBTC）中推荐进行组织二代测序（NGS）检测。然而，组织NGS常因获取困难和组织材料不足而受限。研究者利用循环肿瘤DNA（ctDNA）作为aBTC分子谱分析的替代方法。研究者回顾性分析了10937例aBTC患者，以描述分子谱并评估ctDNA谱分析的临床有效性。在第二个回顾性队列中，来自西班牙九个转诊中心的126例患者具有可用的临床和肿瘤组织注释，评估了配对组织和ctDNA NGS检测及周转时间（TAT）。血样使用全面ctDNA NGS检测（Guardant Health）进行分析。基因组变异（GA）根据欧洲肿瘤内科学会（ESMO）分子靶点临床可操作性量表（ESCAT）进行分类。

在总体队列中，ctDNA NGS揭示了与组织测序相当的分子谱，包括ESCAT可干预GA的检出率。较高的ctDNA负荷与较差的总生存期相关[ctDNA未检测到组为27.7个月（95%置信区间[CI]， 24.1-33.8），低ctDNA负荷组为18.5个月（95% CI， 16.7-20.2），高ctDNA负荷组为13.6个月（95% CI， 12.5-15）；log-rank P<0.0001]。在独立队列中，ctDNA NGS在90%的患者中可用，而组织NGS为50%。ESCAT GA的总体一致性为83%，包括FGFR2融合的80%。ctDNA的中位TAT短于组织（8天 vs. 27天）。在接受ESCAT匹配治疗的小亚组中，生存期似乎更长。

在本回顾性分析中，ctDNA是基于NGS的肿瘤组织检测中用于评估aBTC生物标志物的一种实用替代方案，提供了更好的可及性和更快的检测结果。

研究背景

胆道癌（BTC）是一种罕见的异质性癌症，预后不良。根据胆道系统中的起源部位，肿瘤分为肝内胆管癌（iCCA）、肝外胆管癌（eCCA）和胆囊癌。超过半数的患者在诊断时已为晚期或不可切除疾病。在此背景下，近期在标准铂类双药方案（顺铂-吉西他滨）基础上加入免疫检查点抑制剂——度伐利尤单抗或帕博利珠单抗——已成为一线标准治疗，中位总生存期（mOS）约为13个月。

目前，随着可成药的分子变异的识别，BTC的治疗机会正在扩大。约40%的BTC携带可干预的基因组变异（GA），包括IDH1突变、FGFR2融合、ERBB2扩增和BRAF V600E及KRAS G12C突变。BTC是一种高度异质性疾病，iCCA和eCCA之间存在显著的分子差异。虽然FGFR2融合和IDH1突变在iCCA中更常见，但KRAS和ERBB2的变异在eCCA中更常见。针对这些分子变异的多种靶向治疗已显示出临床获益，并已获批用于晚期BTC（aBTC）的治疗。

为了协调并为临床医生提供系统框架，已出现多种将GA作为癌症精准医学靶点进行排序的分类系统。ESMO分子靶点临床可操作性量表（ESCAT）根据特定变异作为临床可操作靶点的可用证据强度定义了六个类别。相应地，ESCAT可用于指导癌症（包括难治性BTC）患者选择靶向治疗。ESCAT I级是来自临床试验证据最强的类别，其中靶点适合常规使用，当检测到特定分子变异时推荐特定药物。aBTC中的ESCAT I级GA包括IDH1突变（8%-18% iCCA）、FGFR2融合（5%-15% iCCA）、ERBB2扩增（10%-20% eCCA）、BRAF V600E突变（5%）和KRAS G12C突变（1%）。

鉴于BTC从精准医学中获益的证据不断积累，ESMO建议在aBTC患者中实施使用多基因panel的二代测序（NGS），其中包括ESCAT I级GA。目前，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织活检的NGS是金标准。然而，基于组织的基因组检测在BTC中存在重要局限性，包括获取肿瘤活检的技术困难、样本稀缺或质量欠佳，以及获得细胞学而非组织活检。此外，在大多数情况下，肿瘤组织活检不能代表BTC的肿瘤异质性。在此情况下，循环肿瘤DNA（ctDNA；即所谓的液体活检）测序正成为组织分子检测的潜在替代方案，可能通过微创方法克服这些障碍。

携带肿瘤特异性分子变异的ctDNA存在于癌症患者血液的细胞游离部分。ctDNA测序技术正在迅速改进，在癌症患者中的应用证据不断增加。特别是，对于晚期癌症患者，液体活检可用于识别GA以指导靶向治疗，正如ESMO所推荐。经过验证且具有足够灵敏度的全面ctDNA NGS检测具有评估广泛GA panel的优势，包括核苷酸变异[单核苷酸变异（SNV）或突变]、基因融合和拷贝数变异（如扩增）。

本研究评估了基于血液的ctDNA NGS基因分型在aBTC患者中评估ESCAT临床可干预分子变异的可行性和临床实用性。共有10937例连续的局部晚期不可切除或转移性BTC患者采血并使用Guardant360细胞游离DNA（cfDNA）NGS检测分析ctDNA，作为常规临床护理的一部分（总体队列）。在一个独立的126例aBTC患者队列中，来自西班牙九个肿瘤转诊中心，有详细的临床注释，包括临床病理特征、局部NGS组织检测、治疗和生存结局（临床和组织注释队列；图1）。所有126例患者均在一线治疗时单次采血用于ctDNA分析。在接受FGFR2抑制剂治疗的两例患者中，治疗期间和疾病进展时也采集了系列血液。ESCAT I级包括aBTC特异性GA（IDH1突变、FGFR2融合、BRAF V600E突变、ERBB2扩增和KRAS G12C突变）和肿瘤不可知GA（MSI-H、NTRK融合和RET融合）。

图1

 

研究结果

患者特征：

研究流程图见图1。2014年至2024年间，共有10937例连续的局部晚期不可切除或转移性BTC患者采集了单次血样，并作为常规临床护理的一部分分析了ctDNA。这是一个假名化队列（总体队列），其中4227例患者有可用的生存结局。在一个独立的126例患者队列中，来自2019年至2021年西班牙九个转诊中心，有详细的临床和组织注释（亚队列）。该亚队列的临床病理特征、治疗和临床结局见表1。超过90%的患者有转移，75%的病例有内脏受累。约半数患者诊断为iCCA。

表1

临床特征在iCCA和eCCA患者之间相似，尽管eCCA患者原发肿瘤手术更频繁（37.5% vs. 28.6%），且iCCA患者更常接受辅助治疗（80% vs. 52.4%）。在治疗方面，几乎所有患者（97.6%）接受了全身治疗，吉西他滨加铂类联合方案是最常见的方案（84.9%的患者）。

10，937例aBTC患者的ctDNA分子谱和ESCAT变异：

为描述aBTC患者的ctDNA分子谱，研究者使用能够检测点突变、小插入和缺失、基因融合和拷贝数变异的全面NGS ctDNA检测分析了10937例连续诊断为aBTC患者的血样。ctDNA中最常检测到的GA是TP53突变（占病例的42%）和KRAS突变（占病例的18%；图2A）。ESCAT I级变异的发生率见图2B，包括IDH1突变（8.3%）、FGFR2融合（2.4%）、BRAF V600E突变（1.8%）、ERBB2扩增（2%）和KRAS G12C突变（1.3%）。肿瘤不可知ESCAT I级GA包括MSI-H（1.4%）和NTRK融合（0.1%）。最常见的IDH1突变是R132C（72.4%）（图2C），最常见的FGFR2融合伴侣是BICC1（37.7%）（图2D）。总共鉴定出310种不同的FGFR2融合伴侣。

图2

在4227例有生存数据的aBTC患者亚组中分析了ctDNA中检测到的ESCAT I级变异的预后价值（治疗数据不可用）。有趣的是，ctDNA中检测到ERBB2扩增或BRAF突变的患者与无ESCAT I级变异的患者相比，生存结局更差。相反，ctDNA中有IDH1突变或FGFR2融合的患者生存期更长。鉴于先前在较小队列中的研究表明IDH和FGFR2变异的肿瘤可能具有与野生型肿瘤相似的预后，这些观察到的生存差异可能部分是由于使用已获批的IDH或FGFR2抑制剂治疗，并反映了靶向治疗的使用而非内在肿瘤生物学。值得注意的是，本研究中60%和77%的患者分别在IDH1和FGFR2抑制剂获批后入组。然而，这些结果纯属探索性和假设生成（图2E）。

ctDNA和组织肿瘤中检测到的ESCAT变异的比较：

接下来，研究者评估了ctDNA中GA检测与标准治疗肿瘤组织相比的相关性。为此，研究者分析了126例有注释临床和组织数据的患者队列，其中肿瘤组织NGS作为当地常规临床实践的一部分被指示。126例患者中有64例（50.7%）可获得组织NGS检测。未进行组织NGS的原因是缺乏可用组织（23/126， 18%）或活检样本质量差、不足或坏死（40/126， 31%）（图1）。在进行组织NGS检测的64例患者中，49例（76.5%）检测到GA。组织中最常检测到的GA包括KRAS突变（21%）和TP53突变（18%）。ESCAT I级可干预变异在21.8%（14/64）患者的肿瘤中检测到，包括IDH1突变（8/64， 12.5%）、FGFR2融合（5/64， 7.8%）和KRAS G12C突变（1/64， 1.6%）。值得注意的是，在一个样本中通过IHC检测到ERBB2过表达，但由于样本质量差，未通过NGS识别。每个组织样本仅检测到一种ESCAT变异。

所有126例患者均在一线治疗时采集了ctDNA NGS检测的血样，并对所有血浆样本进行了NGS检测（图1）。ctDNA全面NGS检测在90%的患者（117/126）中检测到cfDNA的存在。在9例ctDNA不可检测到的患者中，3例为不可切除的非转移性疾病，3例仅有淋巴结或腹膜转移。该队列中GA的频率与总体队列中观察到的一致。类似地，TP53和KRAS是最常变异的基因（分别为50%和22%）。ESCAT I级GA在22.2%的患者（28/126）中鉴定出，包括IDH突变（14/126， 11.2%）、FGFR2融合（4/126， 3.2%）、KRAS G12C突变（3/126， 2.4%）、BRAF V600E突变（1/126， 0.8%）、ERBB2扩增（2/126， 1.6%）和MSI-H（4/126， 3.2%）。值得注意的是，最常见的IDH1突变是R132C，最常见的FGFR2融合伴侣是BICC1。每个血浆样本仅检测到一种ESCAT变异。从不可切除或转移性疾病诊断到ctDNA采集的间隔时间在部分患者（n=100）中可用，中位为71天（范围-263至1，689天），反映了常规临床实践中液体活检时间的可变性。随后研究者评估了64例有配对组织和血浆样本进行NGS检测的患者中GA检测的一致性。

aBTC中两个最常变异基因在ctDNA和组织样本中的检出率分别为：TP53突变检测46% vs 18%，KRAS突变检测18% vs 21%（图3A）。至少有一种ESCAT I级GA的患者比例在ctDNA中为25%（16例患者），在组织中为21.8%（14例患者）。ctDNA和组织中ESCAT I级GA检测的总体一致性为82.4%。特别是，ctDNA和组织中IDH1突变（16%， 10/64 vs 12.5%， 8/64；总体一致性80%）和FGFR2融合（6.25%， 4/64 vs 7.8%， 5/64；总体一致性80%）的检出频率相似。在组织肿瘤中检测到FGFR2融合但ctDNA中未检测到的两例不一致病例中，融合伴侣对应罕见的FGFR2重排（WRAP73和FLJ31813）。KRAS G12C突变检测的总体一致性为100%（1.6% vs1.6%， 1/64）。相反，ERBB2扩增在ctDNA中的检出频率高于组织样本（1.6%， 1/64 vs 0%；图3B）。值得注意的是，ERBB2扩增未通过组织NGS检测到，而在相应组织样本中通过IHC鉴定出ERBB2过表达。

图3

ctDNA与肿瘤组织NGS检测的TAT比较：

为评估ctDNA与组织相比基因组结果的TAT，研究者分析了临床注释队列中126例患者的数据。从样本采集到出结果的中位TAT，ctDNA检测显著短于组织检测（8天 vs 27天；范围6-16 vs 1-90天；P<0.0001），提示使用ctDNA检测可加速生物标志物的发现（图3C）。

根据ESCAT匹配靶向治疗的生存结局：

研究者根据ESCAT I级GA的存在和使用匹配靶向治疗评估了生存结局。临床注释亚队列中有106例患者有可用的生存数据。13例携带ESCAT I级GA（通过ctDNA和/或组织检测）的aBTC患者在难治性环境中根据监管批准或在临床试验中接受了匹配靶向治疗。ESCAT靶向治疗包括IDH1抑制剂（n=4）、FGFR2抑制剂（n=6，一例患者接受了两线不同的治疗）、ERBB抑制剂（n=1）、BRAF抑制剂（n=1）、KRAS抑制剂（n=1）和针对MSI-H肿瘤的免疫治疗（n=1）。

在未接受匹配靶向治疗的有ESCAT I级变异的患者中，mOS为9.7个月[95%置信区间（CI）， 5.2-27.3]。无ESCAT I级变异患者的生存期在数值上更长（mOS， 14.4个月；95% CI， 11.7-20.8），尽管此差异无统计学显著性（HR， 0.73；95% CI， 0.43-1.24；P=0.24）。

相比之下，有ESCAT I级变异并接受匹配靶向治疗的患者总生存期更长（mOS， 35.3个月；95% CI， 25.3-未达到），与未接受匹配治疗的患者相比（mOS， 9.7个月；95% CI， 5.2-27.3；HR， 0.36；95% CI， 0.17-0.77；P=0.008；图3D）。鉴于样本量小和回顾性设计，这些发现应谨慎解读，因此被视为假设生成。

两例FGFR2融合阳性iCCA患者接受FGFR抑制剂（佩米替尼和福巴替尼）治疗的纵向ctDNA监测，突显了ctDNA追踪治疗反应的潜力。

ctDNA负荷和ctDNA异质性的预后价值：

除了ctDNA在检测可干预致癌驱动因子以指导可用靶向治疗方面的作用外，ctDNA水平可能具有预后意义，可能反映肿瘤负荷。为评估这一点，根据ctDNA负荷的生存结局在来自总体队列的4227例有生存注释的患者中进行了评估（图1）。样本中最常检测到的变异的VAF（变异丰度）用作每位患者ctDNA总负荷的替代指标（MVAF）。研究人群的中位MVAF为1.5（范围0.01-91.7）。研究者根据MVAF建立了三组：高ctDNA负荷（MVAF>1.5）、低ctDNA负荷（MVAF<1.5）和ctDNA不可检测到。高ctDNA负荷患者的总生存期显著更差（mOS， 13.6个月；95% CI， 12.5-15），与低ctDNA负荷患者（mOS， 18.5个月；95% CI， 16.7-20.2）和ctDNA不可检测患者（mOS， 27.7个月；95% CI， 24.1-33.8）相比（图4A）。

 

图4

ctDNA的另一个潜在优势是其能够通过检测单个患者内原发肿瘤和转移部位的克隆和亚克隆GA来捕获肿瘤异质性。为探索肿瘤异质性是否与预后相关，研究者使用每个样本中检测到的GA总数作为异质性的替代指标，在4227例有生存注释的患者队列中进行了分析（图1）。ctDNA中有三个或更多GA的患者与有一到两个变异或无检测到变异的患者相比，总生存期显著更差（图4B）。这些发现提示ctDNA衍生的肿瘤异质性测量可能具有预后相关性。

这些发现在本研究的独立队列中得到进一步验证。相比之下，肿瘤组织中检测到的GA数量与生存期无关。类似地，携带多个ESCAT I级变异的患者生存结局更差（图2E）。

讨 论

本研究报告了通过使用全面NGS检测进行ctDNA基因组谱分析评估的最大aBTC患者真实世界队列。本研究发现证明了ctDNA检测在常规临床实践中的可行性，并支持其在识别可干预GA方面的临床实用性及其潜在的预后价值。

在10937例患者的队列中，ctDNA谱分析重现了BTC已知的分子谱，包括检测到ESCAT I级可干预变异。在一个有配对组织和ctDNA的独立队列中，ESCAT I级GA的总体一致率超过80%，且ctDNA检测的TAT显著短于肿瘤组织检测，加快了潜在有效的ESCAT匹配靶向治疗的启动。值得注意的是，半数患者无法获得组织NGS，对于这些患者，基于血浆的测序是精准医学的唯一机会，突显了ctDNA作为实现分子谱分析和精准医学可及性的替代方法的临床相关性。

鉴于BTC中多种靶向治疗近期获得监管批准，这些发现强调了分子谱分析在晚期疾病管理中的关键作用。这与ESMO精准医学工作组关于实体瘤NGS使用指南的最新更新一致。然而，在BTC中获取高质量肿瘤组织进行基因组分析仍然具有挑战性，因为肿瘤位置和活检标本中常见的坏死内容物可能限制基于组织NGS的成功。在此背景下，ctDNA已成为aBTC分子谱分析的微创替代方法。先前研究已报道组织和基于ctDNA的检测之间高度一致。例如，Hwang及其同事使用AlphaLiquid 100平台评估了102例aBTC患者的队列。在该研究中，可干预变异（ESCAT I-II级）在34.3%的患者中检测到，灵敏度为84.8%，阳性预测值为79.4%。当限于I级变异（不包括KRAS G12C）时，检出率为16.7%，与Berchuck及其同事报告的发现一致，尽管他们的研究未包括MSI-H或KRAS G12C变异。

在本研究中，ctDNA和组织之间ESCAT I级变异的一致性很高。然而，TP53突变在ctDNA中的检出频率高于组织。这部分可能是由于检测设计的差异，因为TP53并非总包含在基于组织的NGS全测序panel中，而Guardant360检测提供TP53的全面覆盖。此外，与单点组织活检相比，ctDNA可能更好地捕获原发和转移部位的肿瘤异质性。虽然技术因素可能导致这些差异，但意义未明的克隆性造血（CHIP）的潜在影响不能完全排除，尽管商业ctDNA检测中已实施生物信息学过滤方法以最小化此效应。

ctDNA在aBTC中临床应用面临的挑战包括基因融合检测的局限性。特别是，由于匹配靶向治疗的近期获批，FGFR2融合在aBTC中特别受关注。先前研究报告了组织和ctDNA检测FGFR2重排的一致性各异，灵敏度范围从18%到66%。在本研究队列中，尽管样本量有限，FGFR2融合的一致性达到80%。这可能反映了较新ctDNA NGS检测设计的改进，其增强了融合检测的灵敏度。值得注意的是，两例不一致病例携带非常罕见的FGFR2重排变异，在组织中检测到但在ctDNA中未检测到。相比之下，最常见FGFR2融合伴侣的一致性为100%。

本研究发现表明，ctDNA检测相比组织分析显著缩短TAT，从而能够更快地识别可干预变异。虽然靶向治疗尚未成为晚期胆管癌一线治疗的标准，但多项III期临床试验正在评估其早期应用，这强调了及时分子检测结果日益增长的重要性。显著例子包括评估福巴替尼的FOENIX-CCA3（NCT04093362）、评估佩米替尼的FIGHT-302（NCT03656536）、评估艾伏尼布的NCT06501625以及评估泽尼达妥单抗的HERIZONBTC-02（NCT06282575）。

除了指导靶向治疗的作用外，ctDNA可能还具有预后意义。在本研究中，ctDNA负荷和ctDNA异质性均与aBTC患者的生存结局相关，提示其作为预后生物标志物的潜在实用性。这些发现与其他肿瘤类型中的观察一致，其中ctDNA的定量测量如VAF或肿瘤分数已与临床结局相关。

本研究存在若干局限性。首先，两个队列均为回顾性分析，可能引入固有偏倚来源。其次，大型总体ctDNA队列缺乏超出生存结局的详细临床病理注释，限制了调整已确立预后因素的能力。第三，接受ESCAT匹配靶向治疗的患者数量相对较少，因此该亚组的生存分析应解读为探索性和假设生成。最后，虽然配对组织-血浆队列提供了检测方法之间一致性的宝贵真实世界见解，但配对样本数量仍然有限。

总之，基于ctDNA的基因组谱分析是aBTC患者分子特征描述的一种可行且临床信息丰富的方法。在这项大型真实世界研究中，ctDNA检测对ESCAT I级变异与基于组织的NGS显示出高度一致性，并提供更快的TAT，支持其在组织肿瘤不可用或不足时作为实用替代方案的作用。除了实现精准肿瘤学的可及性外，ctDNA衍生的生物标志物还可能提供预后信息，尽管这些发现应被视为探索性。总体而言，ctDNA检测代表了支持临床决策和促进常规实践中靶向治疗实施的有价值工具。

参考文献：

Visa L, Badia-Ramentol J, Fernández MC, et al. Next generation sequencing of circulating tumor DNA for precision medicine in patients with advanced biliary tract cancers. Clin Cancer Res. Published online June 1, 2026. doi:10.1158/1078-0432.CCR-26-0096

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