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背景介绍

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，5年生存率仍低于16%。放射治疗是肺癌多模式治疗的重要组成部分，但放疗抵抗涉及放疗失败、转移、复发和不良预后。与放疗抵抗相关的一个主要因素是肿瘤细胞内蛋白质翻译后修饰的失调，这些修饰负责DNA修复途径的激活和凋亡的抑制。除了DNA损伤，辐射还会产生活性氧，导致脂质等生物分子氧化。铁死亡是一种铁依赖、脂质过氧化驱动的细胞死亡方式，近年来的研究表明铁死亡在放疗反应中发挥重要作用。然而，翻译后修饰如何调控铁死亡以影响放疗反应，仍缺乏深入研究。

研究思路

针对上述挑战，南昌大学桑毅教授、中山大学孙逸仙纪念医院胡开顺教授及重庆大学癌症医院的向廷秀教授团队通过结合CRISPR文库和肺癌患者来源类器官，筛选出HDAC4作为放疗抵抗的关键翻译后修饰相关蛋白。研究发现，HDAC4通过其E3 SUMO连接酶活性对MBD1进行SUMO化修饰（主要在K366位点），阻止MBD1的泛素化降解，从而稳定MBD1蛋白。稳定的MBD1结合到TP53和CYP1A1基因启动子的CpG岛，抑制其转录，进而减少脂质活性氧的形成和铁死亡，最终促进放疗抵抗。基于此机制，团队以HDAC4抑制剂tasquinimod为靶头，设计合成了PROTAC降解剂TP1（含烷基链linker），该化合物通过招募CRBN E3泛素连接酶，特异性诱导HDAC4的泛素-蛋白酶体降解。在肺癌类器官和异种移植模型中，TP1相比tasquinimod显著增强放疗敏感性，促进铁死亡，且对正常肺类器官毒性较低。相关内容以“An HDAC4-specific PROTAC degrader achieves radiation sensitization by enhancing ferroptosis in lung cancer”为题，发表在Nature Communications。

图片解析

图1. CRISPR筛选揭示HDAC4是肺癌放疗抵抗的关键驱动因子： (a-b) 六种肺癌类器官（LCO-1至LCO-6）经9 Gy照射后SYTOX Green染色检测细胞死亡，LCO-4表现出最强放疗抵抗。(c-d) 在LCO-1和LCO-4中进行的CRISPR筛选结果，基于beta评分排序。(e) 两种类器官中共同下调的前20个基因的Venn图，HDAC4等基因重叠。(f) 六种LCOs经9 Gy照射后HDAC4免疫荧光染色，5种LCOs中HDAC4表达升高。(g-j) 敲低HDAC4后，LCO-1和LCO-4在递增剂量照射下的类器官存活数及SYTOX Green阳性面积，敲低HDAC4显著增加放疗敏感性。(k) LCO-3中过表达WT HDAC4、C292S（SUMO化失活突变）或H803A&D840N（去乙酰化失活突变）的蛋白水平。(l-m) 过表达不同HDAC4突变体的类器官在9 Gy照射后的存活数，C292S突变体无法促进放疗抵抗，而去乙酰化失活突变体仍能促进抵抗，表明HDAC4的E3 SUMO连接酶活性是放疗抵抗的主要驱动因素。

图2. HDAC4通过其E3 SUMO连接酶活性抑制铁死亡来增加放疗抵抗： (a) A549和H460细胞中shRNA敲低HDAC4的蛋白水平验证。(b-e) HDAC4敲低细胞经6 Gy照射后C11-BODIPY流式检测脂质ROS，敲低HDAC4显著增加脂质ROS积累。(f) 透射电镜显示HDAC4敲低后线粒体萎缩、膜密度增加、外膜破裂，为铁死亡特征。(g-j) Ferrostatin-1（铁死亡抑制剂）处理可逆转HDAC4敲低诱导的脂质ROS积累。(k-l) 在HDAC4敲除细胞中回补WT HDAC4或去乙酰化失活突变体可抑制脂质ROS，而SUMO化失活突变体无此效果。(m-n) 过表达不同HDAC4突变体对SYTOX Green阳性面积的影响，仅WT和去乙酰化失活突变体减少细胞死亡。

图3. HDAC4催化MBD1的SUMO化： (a) SFB-HDAC4稳定表达A549细胞的串联亲和纯化及考马斯亮蓝染色，箭头示HDAC4。(b) 内源性HDAC4与MBD1的免疫共沉淀。(c-d) 0或10 Gy照射后1小时HDAC4与MBD1的原位邻近连接分析（PLA），照射后相互作用显著增强。(e) 核质分离结合免疫共沉淀显示照射后核内HDAC4-MBD1复合物增加。(f-g) MBD1主要与SUMO3结合，而非SUMO1/2。(h-i) HDAC4敲低显著减少MBD1的SUMO3修饰。(j) WT HDAC4增加MBD1的SUMO3修饰，而C292S突变体无此作用。(k) 照射增强HDAC4介导的MBD1 SUMO化。

图4. MBD1在K366位点的SUMO化增加其稳定性： (a) HDAC4过表达增加MBD1蛋白水平，敲低则降低，但mRNA水平不变。(b) MBD1 K366R突变消除HDAC4诱导的蛋白水平升高。(c) K366R突变显著降低MBD1的SUMO3修饰。(d-e) HDAC4敲低缩短WT MBD1半衰期，但不影响K366R突变体。(f-g) HDAC4 C292S（SUMO化失活）不影响MBD1半衰期。(h-k) HDAC4过表达减少WT MBD1的泛素化，敲低则增加；K366R突变体不受HDAC4调控。(l) C292S突变体不影响MBD1泛素化。(m-o) 肺癌患者组织中HDAC4与MBD1蛋白水平呈正相关（n=42，χ²检验p=0.002）。

图5. HDAC4通过MBD1抑制铁死亡和放疗敏感性： (a-b) LCO-1中MBD1的CUT&Tag-seq分析，显示MBD1结合图谱。(c) MBD1在TP53和CYP1A1启动子区的结合峰。(d-e) 敲低HDAC4或MBD1后TP53和CYP1A1 mRNA水平升高，WRAP53不变。(f) 敲低HDAC4或MBD1后p53和CYP1A1蛋白升高，SLC7A11降低。(g-h) 染色质免疫共沉淀（ChIP）显示HDAC4敲除减少MBD1与TP53和CYP1A1启动子的结合。(i) MBD1敲低逆转HDAC4对p53和CYP1A1的抑制作用。(j) 机制示意图。(k) MBD1 siRNA或CYP1A1过表达逆转HDAC4过表达细胞中的脂质ROS抑制。(l) HDAC4敲低细胞中回补MBD1-WT可逆转脂质ROS升高，K366R突变体无此效果。(m-p) MBD1-WT逆转HDAC4敲低诱导的细胞死亡，K366R无效。

图6. 基于Tasquinimod的PROTAC TP1诱导HDAC4降解： (a) TP1和TP2化学结构及PROTAC介导HDAC4泛素化降解示意图。(b) TP1处理不同时间后H460和A549细胞中HDAC4蛋白水平，24小时达最大降解。(c-e) TP1处理LCOs后，明场图像(c)、IHC(d)和IF(e)显示HDAC4和MBD1表达降低。(f-g) SPR分析显示TP1和TasQ与HDAC4蛋白的亲和力KD分别为88.24 nM和36.45 nM。(h) SPPIER实验显示TP1诱导HDAC4与CRBN形成三元复合物（黄色液滴），TasQ不能。(i) BiFC实验显示HDAC4-VN173与CRBN-VC155在TP1处理后产生荧光信号。(j) DIA定量蛋白质组学显示TP1对HDAC4具有高度特异性降解活性。(k) TP1促进HDAC4的泛素化。(l) 蛋白酶体抑制剂MG132阻断TP1诱导的HDAC4降解。

图7. TP1在增强铁死亡方面优于Tasquinimod： (a-b) RNA-seq显示TP1处理的A549和H460细胞中TP53上调、SLC7A11下调等。(c-d) TP1处理降低HDAC4、MBD1、SLC7A11水平，升高p53和CYP1A1水平。(e-f) TP1处理显著增加脂质ROS积累，TasQ无此效果。(g) 透射电镜显示TP1处理导致线粒体萎缩、膜密度增加。(h) 体内实验设计。(i-l) 在CDX小鼠模型中，TP1联合放疗显著抑制肿瘤生长，效果优于TasQ联合放疗。

图8. TP1促进肺癌类器官的放疗敏感性： (a-b) 不同LCOs和正常肺类器官对TP1和TasQ的IC50值，HDAC4高表达的LCO-1和LCO-4对TP1更敏感。(c) TP1处理后LCOs中HDAC4、MBD1、SLC7A11降低，p53和CYP1A1升高。(d-g) TP1联合放疗显著减少类器官存活数和增加SYTOX Green阳性面积，效果优于TasQ。(h) 机制总结图：HDAC4通过SUMO化MBD1抑制p53和CYP1A1表达，减少脂质过氧化和铁死亡，导致放疗抵抗；TP1通过降解HDAC4逆转这一过程，增强放疗敏感性。

结论

本研究首次揭示了HDAC4通过其E3 SUMO连接酶活性而非去乙酰化酶活性促进肺癌放疗抵抗的机制。HDAC4对MBD1的K366位点进行SUMO化修饰，抑制MBD1的泛素化降解，使其稳定并结合到TP53和CYP1A1基因启动子，抑制其转录，从而减少脂质活性氧积累和铁死亡。基于此机制，团队以tasquinimod为靶头设计合成了PROTAC降解剂TP1，该化合物通过招募CRBN E3连接酶特异性降解HDAC4。TP1在肺癌类器官和异种移植模型中表现出比tasquinimod更优的铁死亡诱导能力和放疗增敏效果，且对正常肺类器官毒性较低。该研究为克服肺癌放疗抵抗提供了新的治疗策略，并展示了靶向HDAC4的PROTAC作为放疗增敏剂的临床转化潜力。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-026-73682-0