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背景介绍

mRNA疫苗的成功激发了mRNA疗法在再生医学和基因编辑等广泛疾病治疗中的应用。然而，mRNA固有的不稳定性，特别是在氧化应激条件下，严重制约了这些应用的发展。在受损器官或组织中存在大量活性氧和活性氮物种，可破坏mRNA的完整性并导致翻译错误和失败，最终导致蛋白质表达不理想。尽管传统的脂质纳米颗粒能有效保护mRNA免受核酸酶降解，但对活性物种的防护能力不足，在氧化应激环境中mRNA易发生氧化降解或形成脂质-mRNA加合物，使mRNA有效载荷无法翻译。因此，迫切需要开发能够抵抗活性物种氧化降解的mRNA递送系统。

研究思路

针对上述挑战，新加坡国立大学倪倩倩教授、复旦大学赵梦瑶教授团队提出了一种将抗氧化脂质整合到LNP中的通用策略，用于保护mRNA免受氧化降解。团队基于SM-102（Moderna Spikevax™中使用的可电离脂质）设计并合成了16种抗氧化离子化脂质库，涵盖烷基、不饱和烯/炔、杂环、硫醇/二硫化物和苯酚五类抗氧化基团。通过系统筛选，含4-羟基苯基修饰的抗氧化脂质AO12构建的AO12LNPs表现最优，在氧化应激条件下抗氧化评分达89%（传统cLNPs为57%）。机制研究表明，苯酚衍生的抗氧化脂质具有强氧化还原活性，能高效淬灭多种活性物种并抑制离子化脂质氧化。在急性肝损伤、慢性肝纤维化、肺纤维化和银屑病等多种氧化应激相关疾病模型中，AO12LNPs递送的mRNA（包括线性mRNA、环状RNA和CRISPR-Cas9/sgRNA系统）均实现了比cLNPs更高水平和更持久的蛋白表达，显著改善了再生治疗和基因编辑效果。相关内容以“Antioxidant lipid nanoparticles enhance mRNA stability for regeneration therapy and gene editing”为题，发表在Nature Communications！

图片解析

图1. 抗氧化脂质纳米颗粒增强mRNA稳定性用于再生治疗和基因编辑的概念图：(a) 传统cLNPs与AOLNPs平台的比较示意图。AOLNPs整合抗氧化脂质，保护线性mRNA、环状RNA和CRISPR-Cas9/sgRNA系统免受氧化降解，从而在多种疾病模型中增强蛋白产量。(b) 改进的RNA性能应用于炎症性肺损伤（急性肺损伤和慢性肺纤维化）、肝损伤（急性肝损伤和慢性肝纤维化）和银屑病。

图2. AOLNP用于萤光素酶mRNA递送的多步筛选：(a) 16种抗氧化离子化脂质（AO1-16）的化学结构，分为烷基、双/三键、杂环、硫醇/二硫化物和苯酚五类。(b) 不同AO脂质、组分比例和活性物种下AOLNP的体外转染效率评估示意图。(c) HEK-293T细胞中FLuc mRNA-loaded AOLNPs和cLNPs在不同AO/SM-102摩尔比（5%-40%）下的萤光素酶表达效率热图。(d) 不同浓度活性物种（O₂⁻、·OH、H₂O₂、ClO⁻、ONOO⁻）处理后相对萤光素酶表达变化热图。(e) 0.05 mM活性物种处理下各制剂的萤光素酶表达效率雷达图。(f) 各制剂的抗氧化能力评分。(g) PMA刺激RAW264.7巨噬细胞产生活性物种的示意图及FLuc mRNA-loaded AOLNPs在细胞中的相对萤光素酶表达热图。(h) 综合表达效率、体外抗氧化能力和细胞抗氧化能力筛选最优AO12。

图3. AOLNPs抗氧化能力的机制研究：(a) Raw-AO1-16的循环伏安法电化学性质。(b) AOLNPs在RAW264.7细胞中的抗氧化能力与Raw-AO电位的相关性。(c) 活性物种处理后cLNPs或AO12LNPs中FLuc mRNA的变性琼脂糖凝胶电泳图像。(d) 凝胶条带相对强度定量。(e) ·OH或ONOO⁻处理后cLNPs或AO12LNPs中FLuc mRNA的毛细管电泳图。(f) PMA刺激的RAW264.7细胞中转染后不同时间点FLuc mRNA水平的RT-qPCR定量。(g) RAW264.7细胞中活性物种清除实验的共聚焦图像（DCFH-DA检测）。(h) DCF相对强度定量。(i) PMA诱导氧化应激及双萤光素酶实验示意图。(j) 氧化应激条件下FLuc和RLuc表达变化。

图4. AO12LNPs与cLNPs在受损肝或肺组织中的抗氧化能力比较：(a) APAP诱导急性肝损伤实验流程。(b) 线性FLuc mRNA递送后小鼠生物发光图像。(c) 生物发光信号定量。(d) FLuc circRNA递送后离体器官生物发光图像。(e) 信号定量。(f) LPS诱导急性肺损伤实验流程。(g) 离体器官生物发光图像。(h) 信号定量。(i) CCl4诱导慢性肝纤维化实验流程。(j) 处理6 h后小鼠生物发光图像。(k) 信号定量。(l) 单次注射后6 h至7天的生物发光信号定量。(m) 第7天肝纤维化小鼠生物发光图像。(n) 信号定量。

图5. HGF mRNA-loaded AO12LNPs与cLNPs在急慢性肝损伤中对肝功能恢复的比较：(a) APAP诱导急性肝损伤治疗流程。(b-c) 处理后8 h和24 h血清ALT和AST水平。(d) 肝组织H&E和TUNEL染色图像。(e) TUNEL⁺坏死和凋亡细胞定量。(f) CCl4诱导慢性肝纤维化治疗流程。(g-h) HGF蛋白表达的Western blot及定量。(i) 处理后10天血清AST和ALT水平。(j) 肝组织H&E、Desmin和Sirius red染色。(k) Desmin和Sirius red染色胶原覆盖率定量。(l) 纤维化相关生物标志物的相对mRNA表达。

图6. 单细胞RNA测序证实抗氧化HGF mRNA递送平台AO12LNPs加速慢性肝纤维化中的肝功能恢复：(a) scRNA-seq实验设计流程。(b) 16个主要细胞簇的UMAP图。(c) 簇标志基因的表达小提琴图。(d) 纤维化、氧化应激和抗氧化过程相关标志物表达热图。(e) 相关基因相对表达水平。(f) DEGs比较。(g) GO富集分析。(h) GO术语GSEA。(i) 肝星状细胞亚型的假时间轨迹分析。(j) 不同细胞亚型的比例变化。(k) 纤维化、氧化应激和抗氧化过程评分的箱线图。

图7. HGF mRNA-loaded AO12LNPs与cLNPs在博来霉素诱导肺纤维化中对肺功能恢复的比较：(a) 治疗实验流程。(b) 肺组织共免疫染色图像。(c) HGF⁺细胞比例。(d) 治疗后肺部代表性图像。(e) H&E染色。(f) Ashcroft评分。(g) Masson三色染色。(h) 胶原覆盖率定量。(i-m) 肺组织中羟脯氨酸、丙二醛、总GSH、总SOD和过氧化氢酶水平。

图8. Cas9 mRNA/sgRNA-loaded AO12LNPs与cLNPs靶向NLRP3治疗咪喹莫特诱导银屑病的比较：(a) 治疗实验流程。(b) 不同处理后皮肤代表性图像。(c) PASI评分。(d-h) 皮肤水分、经皮水分流失、蒸发冷却热损失、皮肤相对湿度和水分蒸发浓度。(i) 皮肤H&E染色。(j) 表皮厚度。(k) 脾脏代表性图像及重量。(l-n) 皮肤组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA检测。

结论

本研究成功开发了一种将抗氧化脂质整合到LNP中的通用策略，用于保护mRNA免受氧化应激降解。通过系统筛选16种抗氧化离子化脂质，含4-羟基苯基的AO12表现最优，其AO12LNPs在氧化应激条件下能高效淬灭多种活性物种并抑制离子化脂质氧化。在急性肝损伤、慢性肝纤维化、肺纤维化和银屑病等多种氧化应激相关疾病模型中，AO12LNPs递送的线性mRNA、环状RNA和CRISPR-Cas9/sgRNA系统均实现了比传统cLNPs更高水平和更持久的蛋白表达，显著改善了再生治疗和基因编辑效果。单细胞RNA测序揭示了HGF mRNA-loaded AO12LNPs通过下调纤维化和氧化应激相关基因、上调抗氧化基因、促进肝星状细胞静息状态来缓解慢性肝纤维化的分子机制。该研究为开发下一代用于再生治疗和基因编辑的mRNA疗法提供了通用的抗氧化工程框架。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-026-73512-3

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