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为搭建优化的儿童肿瘤基因组医学平台，2022 年 1 月至 2023 年 2 月，研究者联合日本儿童癌症协作组开展了一项全国性癌症基因组谱分析项目。这项前瞻性观察性研究纳入 0–29 岁实体肿瘤患者，配对分析其外周血与 FFPE 肿瘤组织样本。基因组分析采用 TOP2 杂交捕获富集系统，DNA panel 与 RNA panel 分别覆盖 737 个与 455 个基因，同时检测等位基因特异性基因组拷贝数变异。研究共纳入日本 50 家机构的 210 例患者（中位年龄 8 岁；范围 0–25 岁）。其中 154 例（77%）在确诊时或初始治疗中 / 治疗后入组，56 例（27%）在疾病进展或复发后入组。
TOP2 检测结果对明确儿童实体肿瘤诊断具有重要价值。在 204 例获得基因组结果的患者中，147 例（72%）检出具有潜在临床指导意义的变异，其中诊断相关、预后相关与治疗相关变异分别为 111 例（54%）、61 例（30%）、64 例（31%）。45 例（23%）患者检出致癌融合基因。170 例（83%）患者在至少一个基因组区域检出拷贝数变异。2 例患者表现为高肿瘤突变负荷（TMB-H）。17 例（8%）患者在癌症易感基因中携带胚系致病性 / 可能致病性变异。
本研究证实，在儿童肿瘤中开展全国性精准医学平台具有可行性，且 TOP2 系统具备临床应用价值。研究结果支持将基因组数据整合至儿童肿瘤患者的标准临床诊疗中，包括确诊阶段与复发阶段。
研究背景
在日本，每年约有 3000 名 <20 岁的儿童与青少年被诊断为癌症。儿童肿瘤包含种类广泛、异质性强的罕见肿瘤，具有独特的发病机制与分子特征。其固有的诊断复杂性与有限的治疗选择常影响患者预后，而全面基因组谱分析（CGP）在克服诊断与治疗难题方面具有巨大潜力。
日本于 2019 年 6 月正式启动癌症基因组医学（CGM），获批两项 CGP 检测，分别为 FoundationOne CDx 与 OncoGuide NCC Oncopanel 系统，适用于：(1) 晚期 / 难治性癌症患者；(2) 无标准治疗方案的癌症患者。此类 CGP 检测主要为识别成人常见肿瘤的治疗靶点而设计，因此亟需开发更适用于儿童肿瘤精准医学的基因组谱分析系统。在儿童肿瘤领域，识别基因组变异以辅助诊断、预测预后至关重要。鉴于儿童肿瘤基因组的独特特征，理想的基因 panel 应可检测基因组拷贝数变异与基因融合等结构异常。同时，考虑到潜在遗传因素的普遍性，筛查癌症易感基因的胚系变异同样具有重要意义。
为满足上述需求，研究开发了基于双重杂交捕获技术的 DNA/RNA 检测 panel—— 东京大学肿瘤检测 panel（TOP），可从 FFPE 标本中实现目标富集。升级版 TOP2 panel 纳入由儿童肿瘤专家工作组筛选的儿童肿瘤相关基因，并于 2023 年 8 月 1 日获得日本国民健康保险覆盖（GenMineTOP 癌症基因组谱分析系统）。
既往研究证实，第一代 TOP 系统在成人肿瘤中具有较高的分析性能与临床应用价值，198 例患者中 120 例（61%）获得诊断或治疗相关提示。日本儿童癌症协作组 TOP2 研究（JCCG-TOP2）是一项全国性儿童肿瘤基因组谱分析研究，旨在评估儿童肿瘤基因组检测从样本收集到结果报告的全流程可行性，同时收集对结果解读至关重要的人口统计学与临床数据。研究同时评估 TOP2 系统的临床应用价值。本报告总结该项目在精准医学领域取得的进展，数据涵盖从婴儿至年轻成人的 210 例患者，肿瘤类型多样，疾病分期包括初诊、进展与复发病例。
研究方法
TOP2 系统检测内容包括：(1) 肿瘤突变负荷（TMB）；(2) 737 个基因的单核苷酸变异（SNV）、短片段插入 / 缺失与基因扩增；(3) 等位基因特异性基因组拷贝数变异；(4) 455 个基因的融合基因；(5) 5 个基因的外显子跳跃。依据美国医学遗传学与基因组学学会与 Kosugi 团队指南，报告 40 个癌症易感基因的胚系变异。报告 27 个转录基因的每百万转录本数。
在 JCCG-TOP2 研究中，临床证据等级分为三类：(1) 诊断（Dx）；(2) 预后（Px）；(3) 治疗（Tx）。依据分子病理学会 / 美国临床肿瘤学会 / 美国病理学家协会指南以及美国医学遗传学与基因组学学会、癌症基因组联盟共识建议，对诊断与预后类别的基因变异赋予临床证据等级。治疗推荐依据日本医学肿瘤学会、日本临床肿瘤学会与日本癌症协会的证据等级标准 。为评估基因组变异，研究采用分子肿瘤专家委员会（MTB）与专家小组（EP）两步复核流程。每周 MTB 由多学科团队组成，复核基因组结果，整合临床信息与组织病理结果，起草基因组总结报告。EP 进一步复核基因组结果，参与机构的经治医师参与讨论，最终为医师与患者出具基因组总结报告。潜在临床指导意义变异（PAF）定义为证据等级达到 Dx2 及以上、Px2 及以上、TxD 及以上的基因组变异。
研究结果
患者特征：
JCCG-TOP2 研究于 2022 年 1 月至 2023 年 2 月开展，共纳入日本 50 家参与机构的 210 例患者（男性 111 例，女性 99 例）。这些机构包括厚生劳动省依据 CGM 专业能力划分的指定核心医院（n=6）、指定医院（n=13）、协作医院（n=27），以及未分类医院（n=4）。210 例入组患者中，205 例提供肿瘤与外周血配对样本，最终分析 204 例患者的基因组数据。患者特征与研究流程图分别见表 1 与图 1。入组中位年龄 8 岁（范围 0–25 岁）。其中 34 例（16%）在初诊时入组，120 例（57%）在初始治疗中入组，56 例（27%）在疾病进展或复发后入组。
表1
图1
样本质量评估：
中心评估的 205 例肿瘤样本中位肿瘤含量为 70%（范围 20%–90%）。29 例肿瘤行显微切割，其中 23 例在当地机构标记肿瘤区域，6 例在中心机构标记，3 例在中心机构重新标记肿瘤区域。提取的肿瘤 DNA 中位 ΔΔCt 值为 3.4（范围 0.4–6.2），提取的肿瘤 RNA 中位 DV200 值为 84.2%（范围 28.1%–90.7%）。FFPE 蜡块中位保存时间 82.5 天（范围 0–1041 天）。保存时间延长与肿瘤来源 DNA 的 ΔΔCt 值呈正相关，与肿瘤来源 RNA 的 DV200 值及捕获前肿瘤 DNA/RNA 文库产量呈负相关。205 例样本中，6 例因 DNA 与 RNA 提取物量不足（n=1）及捕获前 RNA 文库产量不足（n=5）未通过质控评估（图 1）。205 例患者中，204 例（99.5%）获得可评估 DNA 分析基因组数据，199 例（97.0%）获得可评估 RNA 分析基因组数据。204 例样本中，肿瘤 DNA 平均目标覆盖度 1198 reads，靶向外显子平均 99.9% 覆盖度≥100 reads，外周血 DNA 平均目标覆盖度 704 reads。从样本提交至出具基因组报告的中位周转时间为 57.5 天（范围 41–139 天）。
肿瘤类别与诊断：
204 例分析患者的肿瘤类别与类型见图 2A。主要肿瘤类别包括骨与软组织肿瘤（n=67，33%）、中枢神经系统（CNS）肿瘤（n=60，29%）、外周神经系统（PNS）肿瘤（n=26，13%）、肝脏肿瘤（n=15，7%）与肾脏肿瘤（n=14，7%）。
图2
TOP2 系统检出的基因组变异：
图 2B 总结 204 例患者中检出的代表性基因组变异。204 例样本 DNA panel 分析分别在 122 例（60%）、57 例（28%）、30 例（15%）患者中检出 SNV、小片段插入 / 缺失与基因扩增。变异最频繁的基因包括 TP53、MYCN、SMARCB1、CTNNB1 与 NF1。170 例（83%）患者检出全染色体、染色体臂或片段的拷贝数变异；典型病例见图 3。199 例样本 RNA panel 分析在 44 例（22%）患者中检出融合基因，其中 12 例为治疗可靶向融合基因（图 4 ）。2 例（1%）患者检出外显子跳跃事件（图 4）。基于 204 例患者的 TMB 值，中位肿瘤 TMB 为 0.5 mut / Mb（范围 0–30.5）。2 例（1%）高级别胶质瘤（HGG）患者 TMB≥10 muts / Mb：1 例携带错配修复（MMR）基因 MLH1 胚系突变，另 1 例携带 MMR 基因 MSH2 与 MSH6 体细胞突变。9 例患者肿瘤样本接受过替莫唑胺治疗；与未接受替莫唑胺治疗的患者相比，TMB 值无显著差异（Mann-Whitney U 检验，双侧，p=0.571）。
图3
图4
骨与软组织肿瘤（n=67）中，横纹肌肉瘤（RMS，n=18）、尤因肉瘤（EWS，n=11）与骨肉瘤（n=8）为主要肿瘤类型。疾病定义性融合基因在这类肿瘤中普遍存在（31/67，46%）。RMS 中检出肿瘤亚型特异性基因组变异：腺泡型 RMS 伴 MYCN 扩增，梭形细胞 / 硬化型 RMS 伴 MYOD1 L122R 热点突变，胚胎型 RMS 伴 TP53、NF1 与 YAP1 变异。值得注意的是，融合阴性 RMS 中检出的 FGFR4 V550E 与 N535K 突变为守门突变，提示对目前获批的 FGFR 抑制剂原发性耐药。EWS 中检出反复出现的拷贝数变异，如 1q 获得、8q 获得与 16q 缺失。骨肉瘤中常见 17p 拷贝数变异与非整倍体。炎性肌纤维母细胞瘤中检出 FN1::ALK 融合（图 4A）。2 例梭形细胞形态肿瘤中，1 例携带 KIAA1549::BRAF 融合；另 1 例携带 SOX13::NTRK1 融合（图 4B）。
CNS 肿瘤（n=60）中，髓母细胞瘤（MB，n=14）与弥漫性 HGG（n=14）为主要肿瘤类型。TP53、PDGFRA、PTEN 与 PIK3CA 为变异最频繁的基因。MB 中检出支持分子亚组分类的基因组变异：WNT 激活型 MB 伴 APC 胚系突变与 6 号染色体单体，SHH 激活型 MB 伴 PTCH1 突变与 10q 缺失，3 组 / 4 组 MB 伴等臂染色体 17q 与全染色体变异（如 7 号染色体获得、8 号染色体缺失）（图 3A ）。儿童胶质瘤中，弥漫中线胶质瘤检出组蛋白突变 H3-3A K28M，弥漫半球胶质瘤检出 H3-3A G35V。弥漫性 HGG 中检出受体酪氨酸激酶基因融合，尤其见于婴儿型半球胶质瘤（图 4C、D），而低级别胶质瘤（LGG）中检出 BRAF 融合（图 4E）。非典型畸胎样 / 横纹肌样肿瘤（AT/RT）中检出 SMARCB1 突变与 22q 缺失 / 杂合性缺失（LOH）（图 3B）。肿瘤特异性融合基因确诊 CNS 间叶肿瘤中的尤因肉瘤与 CIC 重排肉瘤。
PNS 肿瘤包括神经母细胞瘤（n=22）与节细胞神经母细胞瘤（n=4），反复检出 MYCN/2p24.3 扩增、17q 获得、1p 缺失、11q 缺失 / LOH 等拷贝数异常（图 3C、D）。MYCN 非扩增型神经母细胞瘤中检出 ATRX 缺失与 TERT 启动子突变。位于 MYCN 附近的 ODC1（2p25.1）与 ALK（2p23.2–p23.1）与 MYCN 共扩增。婴儿神经母细胞瘤中检出近三倍体（预后良好指标）（图 3E）。
肝脏肿瘤（n=14）中，肝母细胞瘤（n=11）为主要肿瘤类型，CTNNB1 与 TERT 为变异最频繁的基因。检出的 CTNNB1 基因组变异包括热点错义突变、框内缺失与外显子跳跃（图 4F）。老年患者中可见 TERT 启动子突变。肝母细胞瘤中普遍存在 1q 获得与 11p LOH 等拷贝数变异。肝细胞癌病例中检出 APC 胚系致病性变异。
肾脏肿瘤（n=14）中，肾母细胞瘤（n=9）为主要肿瘤类型，其中 2 例患者 CTNNB1 基因变异。伴 TP53 突变的肾母细胞瘤呈弥漫间变性组织学形态。肾母细胞瘤中检出 WT1 体细胞突变，而透析后发生肾细胞癌（RCC）的患者中检出 WT1 胚系突变。2 例患者检出 BRAF V600E 突变，1 例为乳头状肾细胞癌与后肾腺纤维瘤复合肿瘤，另 1 例为后肾腺瘤 - 上皮性肾母细胞瘤重叠病变。鉴于后肾肿瘤中 BRAF 突变发生率高，且后肾肿瘤与肾脏恶性肿瘤形态学鉴别困难，BRAF V600E 突变的致癌作用尚不明确。恶性横纹肌样肿瘤中检出 SMARCB1 功能缺失突变与 / 或 22 号染色体 SMARCB1 位点缺失，肾脏间变性肉瘤中检出 DICER1 热点突变。
生殖细胞肿瘤（GCT）（CNS GCT，n=2；非 CNS GCT，n=5）中，反复检出等臂染色体 12p（i12p）、1q 获得与 21q 获得等拷贝数变异。无性细胞瘤中检出 KIT 突变。卵巢未成熟畸胎瘤与卵巢畸胎瘤来源的节细胞神经母细胞瘤样肿瘤中检出全局单亲二倍体，致癌作用未知（图 3F）。
上述未包含的罕见肿瘤（n=17）中，3 例视网膜母细胞瘤检出 RB1 功能缺失突变，其中 2 例伴 13q14 区域 LOH。2 例胸膜肺母细胞瘤检出体细胞 DICER1 热点突变，均伴 14q32 区域 LOH。1 例携带 APC 胚系突变的青少年患肺腺癌，伴 EML4::ALK 融合。2 例甲状腺乳头状癌携带 NCOA4::RET 融合（图 4G）。
TOP2 系统的临床应用价值：
通过计算诊断（Dx1/2）、预后（Px1/2）与治疗（Tx A–D）类别中具有潜在临床指导意义变异（PAF）的患者比例，评估 TOP2 系统的临床应用价值。204 例患者中，111 例（54%）基于基因组数据确诊、细化或重新分类诊断，尤其通过检出融合基因或特征性拷贝数变异实现，多见于骨、软组织与 CNS 肿瘤（表 2）。61 例（30%）患者检出预后相关基因组变异，64 例（31%）患者携带潜在治疗可靶向变异。图 5B 总结 MTB 基于基因组变异推荐的靶向治疗。BRAF/MEK 抑制剂、EZH2/EZH1/2 抑制剂、PI3K/AKT/mTOR 抑制剂、CDK4/6 抑制剂与 ALK 抑制剂为最常推荐的药物类别。
表2
图5
胚系检测结果：
外周血 DNA panel 分析显示，17 例（8.3%）患者在 40 个癌症易感基因中携带致病性或可能致病性胚系变异（表 3 ）。TP53 为最常突变基因，其次为 APC 与 NF1。17 例患者中，7 例既往接受过某种形式的基因组检测：4 例既往分析已确认胚系变异，3 例仅肿瘤谱分析检出潜在胚系变异。17 例患者中仅 3 例一级亲属有癌症家族史。因此，一级亲属患癌的 12 例患者中 3 例（25%）检出致病性或可能致病性胚系变异，而无癌症家族史的 192 例患者中 14 例（7.3%）检出。作为第二等位基因失活的证据，8 例患者确认 LOH 状态，1 例患者检出体细胞二次打击突变。
表3
TOP2 检测结果对医疗决策过程的贡献：
医师完成 197 例患者的反馈调查。通过 TOP2 系统获得的基因组数据对 53 例（27%）患者的临床决策产生影响。具体而言，数据为 29 例（15%）患者提供治疗决策参考，为 16 例（8%）患者明确诊断，为 4 例（2%）患者提供预后评估。TOP2 数据的临床应用价值在初诊时与一线治疗中尤为显著。相反，144 例（73%）患者的基因组检测结果被认为无临床贡献。主要原因包括无可指导临床的变异（107 例，54%）、无法获得靶向治疗（39 例，20%）、已知基因组结果（19 例，10%）与病情恶化无法实施基因组指导干预（1 例，0.5%）。
讨 论
JCCG-TOP2 研究旨在建立并规范适用于儿童肿瘤的优化基因组平台。研究采用 TOP2 双重 panel 系统，FFPE 样本的 DNA 与 RNA 分析均获得高成功率。与既往文献一致，儿童肿瘤基因组突变负荷较低。然而，结合 RNA panel 分析与等位基因特异性基因组拷贝数评估，显著促进了儿童肿瘤特异性致癌变异的识别。融合基因是儿童肿瘤的主要致癌机制，尤其在骨与软组织肿瘤、CNS 肿瘤中。RNA 分析还有助于检出现有 DNA panel 无法检测的非典型基因组断裂点融合与外显子跳跃。此外，拷贝数变异普遍存在，部分为疾病亚型特征性变异且具有临床指导意义。等位基因特异性拷贝数图明确了抑癌基因双等位基因失活事件的机制，为评估检出的胚系事件是否参与当前疾病的肿瘤发生或仅为偶然继发发现提供支持。
已有多项儿童肿瘤分子谱分析研究报道，如澳大利亚零儿童癌症项目 、德国 INFORM 研究、法国 MAAPYACTS 试验、加拿大 KiCS 项目与美国分子特征计划（MCI）。MCI 研究对 188 家机构的 3972 例儿童患者进行谱分析，CNS 肿瘤中 27% 检出基因融合，软组织肿瘤中 40% 检出基因融合，25% 病例实现诊断细化。这些结果凸显大规模数据共享与集中谱分析的价值，尤其对于儿童 CNS 与软组织肉瘤等罕见、诊断困难的肿瘤，其形态异质性与组织病理特征重叠，显著受益于整合基因组分析。此类研究多采用新鲜冷冻肿瘤组织全面分析儿童肿瘤基因组，包括全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）、全转录组测序（WTS）与甲基化组谱分析，难以与本研究结果直接比较。JCCG-TOP2 研究范围与美国开展的 iCAT/GAIN 研究 、儿童 MATCH 研究更相似，均采用临床常规获取的 FFPE 肿瘤样本并开展靶向 DNA panel 测序。iCAT/GAIN 研究中，具有诊断、预后或治疗意义的基因组变异分别见于 61%、16% 与 65% 的患者。儿童 MATCH 研究报道，前 1000 例筛查肿瘤中 31.5% 检出可指导临床的变异，28.4% 患者分配至治疗组，13.1% 患者入组治疗。一项纳入 109695 例全年龄段实体肿瘤的美国大型基因组谱研究（中位年龄 67 岁；范围 1–89 岁）中，临床相关基因组变异作为诊断标志物见于 4.5% 病例（范围 0%–92.3%），作为预后标志物见于 13.2% 病例（范围 0%–76.1%），作为治疗预测标志物见于 47.6% 病例（范围 3.5%–79.7%）。尽管研究设计与基因 panel 组成差异限制直接数值比较，但 JCCG-TOP2 研究中诊断意义变异患者比例与该研究相当。然而，治疗相关变异患者比例显著较低，可能反映儿童与成人人群在分子靶向治疗可及性方面的差异，以及日本与美国在药物研发与监管审批状态方面的差异。
8.3% 患者检出致病性或可能致病性胚系变异，与儿童 MATCH 研究（7%）及近期其他国际研究（10%–11%）的队列结果相似。本研究人群中的实际比例可能略高，部分原因是 TOP2 panel 包含基因有限（n=40），未覆盖罕见儿童肿瘤易感综合征相关基因，如横纹肌样肿瘤易感综合征相关 SMARCB1、DICER1 综合征相关 DICER1。早期准确诊断癌症易感疾病对合理医疗管理、癌症监测与家庭计划至关重要，需要经验证的胚系报告系统与多学科协作。进一步探索性分析正在进行，旨在研究研究患者中 40 个报告基因以外的胚系变异与基因表达谱，结果将在后续论文中报道。
研究强调中心病理复核与样本质控的重要性，这有助于在 CGM 指定与非指定医院参与的多中心场景下，实现 FFPE 肿瘤样本的高测序成功率。基因组与病理结果的整合评估对准确解读与验证基因组结果至关重要，尤其当肿瘤内部存在异质性结构或不同肿瘤类型存在共享基因组变异时。
本研究存在一定局限性。首先，中位周转时间为 57 天，与其他分子谱分析项目相比相对较长，如儿童 MATCH 研究（中位 24 天）与 MCI 研究（21 天内）。主要原因是 MTB 与 EP 的集中复核流程以及基因组总结报告的制备。后续流程优化与对系统的熟悉度提升已缩短该时间。TOP2 获得国民健康保险覆盖批准后，基因组检测目前在国家基因组医学框架内开展，基因组结果通常在 4–5 周内返回。其次，样本量较小，结果可能无法代表整个儿童人群。204 例肿瘤分析中，许多基因组变异仅检出一次，尽管这些变异在各肿瘤类型中至关重要。这凸显收集与共享儿童肿瘤数据对推动数据驱动的基础、转化与临床研究的重要性。尽管研究入组标准允许纳入 29 岁以下患者，但仅 6 例患者年龄≥20 岁。年轻成人代表性有限，部分原因是患者入组通过主要治疗儿童人群的 JCCG 机构开展。
JCCG-TOP2 研究证实 TOP2 检测在儿童肿瘤中具有重要临床应用价值，可提高诊断准确性、促进基于生物标志物的风险分层、发现既往 DNA panel 可能遗漏的额外治疗靶点。这也提示临床实践中早期使用 TOP2 检测的获益。与既往研究一致，本研究结果支持以下结论：在疾病进展前启动精准指导治疗，对有明确靶向治疗证据与 / 或致癌驱动基因（如融合基因）的高风险癌症临床获益最大。肿瘤组织或循环肿瘤 DNA 时序分析积累的证据证实肿瘤进化与治疗可靶向驱动基因的变异，支持进展期肿瘤再次活检。尽管如此，日本现行全民健康保险政策允许每位患者仅接受一次 CGP 检测。该局限性降低 CGP 检测的临床应用价值，使最佳检测时机的确定至关重要。基于医师反馈调查结果，对于诊断不明确或高风险肿瘤特征的病例，早期检测可能尤其有价值，而延迟检测可能捕获与疾病进展相关的变异。在某些临床场景中，重复 CGP 检测可能显著影响患者预后，强调需要个体化检测策略，并支持在临床指征明确时考虑再次检测。
JCCG-TOP2 研究的跨学科协作在儿童肿瘤优化基因组医学领域取得显著进展。超出标准报告范围的基因组数据进一步分析正在进行。研究旨在搭建儿童精准医学平台，提高患者诊疗质量，惠及全球每一位儿童。
参考文献：
Tao, Kayoko et al. “Genomic Profiling of Pediatric Solid Tumors With a Dual DNA/RNA Panel: JCCG-TOP2 Study.” Cancer science vol. 117,2 (2026): 522-535. doi:10.1111/cas.70249