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导读
近年来，单细胞测序与空间组学技术迅速发展，正在深刻改变肝病研究范式。传统肝脏病理研究主要依赖苏木精-伊红染色、免疫组化以及单标志物免疫荧光技术，虽操作成熟、临床可推广性强，但往往只能观察有限数量的分子标志物，难以解析复杂肝脏微环境中多细胞群体的空间分布与互作关系。
无论是代谢功能障碍相关脂肪性肝病或肝炎、原发性硬化性胆管炎，还是肝纤维化与肝癌，其发生发展均涉及肝细胞损伤、免疫细胞募集与活化、胆管反应、肝星状细胞激活、血管及基质重塑等多种细胞类型之间高度动态化、空间化的相互作用。因此，在同一组织切片中实现多细胞、多蛋白标志物的同步可视化与空间定位，已成为空间病理学与肝脏空间生物学的重要研究方向。
近日，来自德国夏里特医学院的Marlene Kohlhepp博士、Adrien Guillot博士及团队，在eGastroenterology发表了题为“Unified platform for multiplex immunofluorescence across liver tissues and engineered models”的原创研究，系统建立了一种适用于肝组织及多种工程化模型的统一多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）平台。本研究不仅能优化当前的mIF流程，同时开发了配套的开源图像预处理软件CytoPrixm，实现了从实验染色、图像采集到图像预处理的一体化工作流程。
图文摘要
基于序贯抗体剥离的mIF统一平台示意图。这一平台适用于肝组织、类器官、原代细胞培养及肝脏器官芯片等多种肝脏相关样本，通过多轮抗体染色、图像采集与抗体剥离循环，实现约10–15种标志物的连续检测，并结合CytoPrixm进行图像配准、背景校正、通道合并及图像标准化处理，为后续细胞分割、空间定位及定量分析提供空间分辨的多参数数据基础。
mIF技术的发展瓶颈
近年来，mIF已广泛应用于肿瘤免疫微环境分析、空间转录组验证、单细胞组学结果的空间定位及多细胞互作网络研究等领域。目前主流高通量空间表型分析或空间组学平台包括：
（1）CODEX / PhenoCycler
（2）Imaging Mass Cytometry
（3）MACSima成像平台
（4）Xenium 等
这些技术能够实现超过60种标志物的同时检测，但存在以下限制：
（1）技术成本较高：通常需要专用成像平台及高成本试剂体系；
（2）实验流程复杂：往往依赖专业空间组学平台、自动化设备以及专门的数据分析团队；
（3）对常规FFPE（formalin-fixed paraffin-embedded）样本兼容性有限：而临床病理实践中最常见的仍是FFPE石蜡样本。
因此，开发一种基于常规荧光显微镜、适用于FFPE组织、可兼容常规实验室流程并能控制成本的多重空间成像平台，具有重要现实意义。
核心创新一：建立统一化序贯mIF工作流程
本研究采用“基于序贯抗体剥离的mIF”（sequential antibody stripping-based mIF）技术路线。其核心原理是在同一张组织切片或同一样本上，重复进行抗体染色、图像采集、抗体剥离、再次染色的循环流程 （见图文摘要）。
研究团队采用十二烷基硫酸钠和β-巯基乙醇构建抗体剥离体系，有效清除上一轮抗体信号。随后，样本重新进行抗原修复，并进入下一轮染色。通过这种方式，同一张FFPE切片可实现约10–15种标志物的连续检测。研究显示：组织在连续多轮洗脱后仍可保持良好的结构完整性。研究者利用连续6天DAPI核染结果验证了组织稳定性与图像重叠一致性，提示这一平台具有较好的重复性与稳定性（见图1）。
图1：mIF在FFPE肝组织中的应用与质量控制。研究团队在健康小鼠FFPE肝组织中进行多轮mIF成像，并通过连续多天DAPI核染结果验证组织在反复染色和抗体剥离后的结构完整性，提示该流程具有较好的稳定性和可重复性。
本研究的重要创新在于，其平台并不限于传统FFPE组织。研究团队进一步将此方法拓展至肝内胆管细胞类器官、原代肝细胞培养、肝脏器官芯片等多种体外工程化模型。这意味着研究者能够在“组织样本—类器官—芯片模型”之间建立相对统一的空间表型分析框架。
图2：mIF用于解析小鼠肝内胆管细胞类器官结构。研究团队在同一类器官样本中连续检测 CK19、β-catenin、ZO-1、Ki67和PCNA等标志物，用于评估胆管细胞极性、细胞连接、增殖状态及管腔相关结构。
在小鼠肝内胆管细胞类器官中，研究团队成功实现了CK19、β-catenin、ZO-1、Ki67、PCNA等标志物的连续检测（见图2）。通过多种标志物联合分析，研究者能够评估胆管细胞极性、细胞增殖状态、细胞连接结构以及管腔相关结构等关键生物学特征。这为类器官成熟度评价及疾病建模提供了新的空间分析工具。
同时，本研究进一步将此技术应用于胆管芯片平台（见图3）。研究者在同一芯片中检测并可视化了肝细胞、胆管细胞、巨噬细胞、内皮细胞和肝星状细胞等多个细胞群体。结果表明，mIF可作为复杂工程化肝脏模型的重要质量控制与机制研究工具，尤其在肝纤维化、胆汁淤积、炎症细胞互作及药物筛选等研究方向中具有广泛应用潜力。
图3：mIF在胆管芯片模型中的应用。研究团队在同一胆管芯片中整合显示肝细胞、胆管上皮细胞、巨噬细胞、内皮细胞和肝星状细胞等多个细胞群体，提示该平台可用于复杂工程化肝脏模型的空间表型分析与质量控制。
关键创新二：CytoPrixm图像分析平台
在mIF技术应用过程中，图像预处理是另一项核心挑战。由于mIF通常涉及多轮染色、多通道图像采集、图像拼接、背景校正与图像配准，因此数据处理流程较为复杂。研究团队开发了CytoPrixm这一开源图像预处理软件，CytoPrixm可实现阴影校正、背景消除、图像拼接、通道合并、DAPI对齐、图像堆栈配准等功能。其重要特点在于不依赖复杂编程背景。这显著降低了mIF的分析门槛（见图文摘要）。
空间病理学中的潜在应用价值与局限性
这一平台的意义并不仅局限于技术层面。其更重要的价值在于推动肝病研究从“单标志物病理”走向“空间生态病理”。
（1）肝病空间微环境解析
研究团队展示了，在Mdr2−/−慢性胆汁淤积模型中，mIF可同步观察胆管反应、巨噬细胞浸润、中性粒细胞聚集、纤维化相关重塑等空间关系。这对于理解原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性胆管炎以及代谢功能障碍相关脂肪性肝炎相关的纤维化等疾病中的微环境重塑具有重要参考价值。
（2）单细胞组学的空间验证
当前单细胞RNA测序虽可识别新细胞亚群和分子状态，但往往缺乏原位空间信息，而mIF可以实现单细胞发现、空间定位、组织结构验证之间的整合。这也是未来空间组学研究的重要发展方向。
（3）AI数字病理与精准医学
随着AI病理的发展，未来疾病分类可能不再局限于传统病理分级，而是进一步整合细胞空间分布、免疫生态结构、空间邻近关系及多细胞互作网络，建立新的数字化病理分析体系。高质量、多分子、空间分辨的成像数据，正是这一体系的重要基础。
（4）技术注意事项
同时，在实际应用中仍需注意若干问题。①实验流程仍较耗时：由于序贯染色尚未完全自动化，因此染色、成像和数据处理均需要较多人工操作。②图像分析复杂度较高：如自发荧光、膜重叠、伪分割等仍需针对具体项目进行优化。③对样本质量要求较高：长期保存或质量较差的FFPE样本，可能无法耐受过多轮洗脱。
总结
本研究建立了一套兼具可及性、扩展性与标准化潜力的mIF平台。其重要价值在于：降低空间病理技术门槛，统一组织样本与工程化模型的空间表型分析体系，推动空间组学与数字病理的进一步融合；为精准肝病研究提供空间维度支持。
在空间生物学迅速发展的背景下，如何将单细胞组学发现真正落实到组织微环境层面，已经成为未来肝病研究的重要方向。本研究提出的“基于常规实验条件的高维空间表型平台”，为肝病空间病理研究提供了一种具有较强推广价值的新思路。
引证本文
Franco Leonardi B, Yin G, Amiridze N, et al. Unified platform for multiplex immunofluorescence across liver tissues and engineered models. eGastroenterology2026;4:e100379.
https://egastroenterology.bmj.com/content/4/2/e100379