深度解析医学证据，DeepEvidence为你支撑决策
小RNA(如miRNA和siRNA)能够精准调控基因表达，在疾病治疗中展现出巨大潜力。然而，未经修饰的小RNA在体内稳定性差、免疫原性较高且细胞摄取效率有限，长期制约其临床应用。传统递送系统(如病毒载体和脂质纳米颗粒)虽在一定程度上改善了这些问题，但仍存在免疫反应、毒性以及组织分布受限等不足，尤其在慢性疾病长期给药场景下挑战更为突出。小细胞外囊泡(sEV)由于来源天然、具有良好生物相容性且可跨越生物屏障，被认为是极具前景的新一代递送载体。然而，其进一步应用仍受限于一个关键瓶颈：缺乏高效、稳定且通用的小RNA装载策略。
2026年4月13日，中山大学附属第八医院伍贵富教授与附属第一医院范文冬副研究员团队在Bioactive Materials发表了题为“Robust loading and delivery of functional small RNAs via protein N-myristoylation-induced small extracellular vesicles”的研究论文，提出了一种全新的RNA装载策略—PMEVL (Protein N-Myristoylation-induced sEV Loading)。该系统通过引入N-肉豆蔻酰化短肽(Myr-peptide)，构建“Myr-peptide + cargo protein”融合蛋白，并在其3’ UTR中嵌入小RNA表达模块，实现了在促进sEV生成的同时增强RNA货物的特异性装载。该平台兼容miRNA、siRNA及mRNA，并支持多RNA及蛋白的联合递送，为RNA药物递送提供了新的技术路径。
一、PMEVL系统：兼具高效性，通用性与特异性
研究团队将来源于CHMP6蛋白的Myr短肽(15 aa)与CNF报告蛋白(融合mCherry、纳米荧光素酶NanoLuc和3×FLAG标签)融合，构建了Myr-CNF系统。该系统既能实时追踪货物的装载过程，又能高效介导小RNA向sEV的分选。结果显示，PMEVL系统可显著提升小RNA装载效率：对于外源化学合成的siRNA-METTL3，其装载量较对照组提升约60倍；对于let-7i-5p miRNA，其装载量提升约15倍。同时，PMEVL还能显著促进sEV分泌，囊泡产量提高约3倍，从而进一步放大整体递送效果。
更值得关注的是，该系统兼具良好的“通用性”与“特异性”。除外源RNA外，其对内源表达的miRNA (如miR-200a-3p、miR-125b-5p、miR-451)的分选效率最高可达1616倍；同时还可适配GFP、mCherry等mRNA，实现多类型RNA货物的高效装载。与此同时，PMEVL对目标RNA具有较强的选择性，对细胞内高丰度但非货物RNA (如let-7i-5p、GAPDH mRNA)几乎无明显富集，从而减低了“无效装载”带来的潜在风险。
关键验证实验进一步证明了该系统的可靠性。RNase保护实验显示，装载的RNA被完整封装于sEV内部，能有效抵抗核酸酶降解；而一旦将Myr肽N端甘氨酸突变为丙氨酸(G2A突变)，破坏肉豆蔻酰化修饰后，sEV分泌及RNA装载能力几乎完全丧失，说明Myr修饰是PMEVL发挥作用的核心基础。此外，PMEVL生成的sEV，能被人脐静脉内皮细胞(HUVECs)高效摄取，并显著抑制靶基因(如KEAP1)的表达，完整实现了“装载-递送-功能发挥”的全过程，为其在心血管疾病中的应用奠定了基础。
二、多RNA装载能力及作用机制解析
在RNA装载策略方面，研究团队引入pri-miR-30a骨架构建人工miRNA系统，使细胞内源性生成治疗性siRNA (如siMETTL3)。与pri-let7b、pri-miR-92a等其他骨架相比，该系统在靶基因沉默效率方面表现更优。
针对心血管疾病中多基因异常调控的特点，团队进一步构建多顺反子表达系统，将siYAP、siEZH2和siMETTL3同步装载，实现多靶点协同调控。实验结果表明，该策略可同时抑制多个靶蛋白的表达，较单一靶点干预更具潜在治疗优势。
机制研究方面，研究团队结合TurboID邻近标记与蛋白质组学分析，首次系统阐明PMEVL的双重作用机制：一方面，Myr肽通过激活ERK1/2并抑制AMPK-自噬通路，促进多囊泡体(MVB)与细胞膜融合释放，从而提高sEV产量；另一方面，通过招募RNA结合蛋白ANXA2及ESCRT复合体关键蛋白(ALIX、TSG101)，促进RNA-AGO2复合体进入sEV，实现RNA的高效且特异性装载。
三、体内外实验验证PMEVL系统的治疗潜力
为验证PMEVL系统在心血管疾病中的治疗价值，研究团队选择Pcsk9作为核心治疗靶点。Pcsk9主要在肝脏表达，其异常表达会促进低密度脂蛋白受体(LDLR)降解，导致血清LDL-C升高，是动脉粥样硬化的重要致病基因。
体外实验显示，PMEVL生成的sEV能高效装载siPcsk9，并被小鼠肝癌细胞(Hepa1-6)高效摄取，从而显著抑制Pcsk9蛋白表达。体内实验中，将DiR标记的PMEVL-sEV经尾静脉注射至小鼠体内后发现，其主要富集于肝脏，且在注射后24小时达到峰值，并可稳定存在约3天。更重要的是，经过8次静脉注射治疗后，小鼠肝脏Pcsk9蛋白水平显著降低，LDLR表达明显恢复，血清LDL-C及总胆固醇水平大幅下降。
安全性方面，未观察到明显毒性：小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)均维持在正常范围，肝、肺、肾等主要器官的HE染色未见明显病理损伤，提示PMEVL合成的sEV具有较好的生物相容性。
四、系统优化：筛选高效Myr肽进一步提升装载能力
在此基础上，团队进一步筛选了181种来源于人类蛋白的Myr短肽，并鉴定出FRS3、FGR、FYN等多个高效候选序列，其递送蛋白货物和RAN货物的能力显著优于初始CHMP6来源的Myr肽。优化后，单个sEV中miR-200a-3p的装载量最高可达1.05拷贝/囊泡，较原始系统提升约2.4倍，同时未对细胞活力产生明显影响，为后续规模化应用和进一步工程化优化提供了新的方向。
五、PMEVL系统的优势与局限
(一)优势
1. 架构灵活，具备较强可编程性
PMEVL采用模块化设计，可通过调整pri-miRNA骨架序列实现不同siRNA的表达，既支持单靶点干预，也能够实现多靶点联合调控。同时，通过替换功能模块，还可拓展至RNA与蛋白的协同递送，具备较强的定制化潜力，适用于多种疾病场景。
2. 同步提升囊泡产量与装载效率
该系统不仅增强了sEV生成能力，还显著提高了核酸货物的封装效率，实现“产量+装载”双提升。相比传统方法，这一特点有助于降低对大规模细胞培养的依赖，为后续产业化和规模化生产提供助力。
3. 基于人源元件，具备较好的安全性基础
Myr短肽来源于人源蛋白，有助于降低外源材料可能带来的免疫风险。在动物实验中，多次给药后未观察到明显肝功能异常或组织损伤，显示出良好的体内耐受性。尽管长期免疫反应仍需进一步评估，但其整体安全性表现良好。
(二)局限性
1. 规模化制备仍面临挑战
与当前多数sEV递送体系类似，PMEVL在大规模分离与纯化方面仍存在效率与成本限制。建立稳定、可放大的生产工艺，仍是其走向临床应用的重要前提。
2. 体内分布偏向肝脏，靶向性仍需拓展
目前PMEVL工程化sEV在体内主要富集于肝脏，对其他组织的递送效率相对有限。未来可通过表面修饰(如引入靶向配体或受体识别结构)，进一步拓展其在非肝脏疾病中的应用潜力。
3. 不同货物间装载效率存在差异
研究表明，该系统对不同类型、不同长度的RNA及蛋白的装载能力差异较大。后续仍需在更广泛的货物体系中进行系统评估，以进一步验证其作为通用递送平台的稳定性与适用范围。
综上，该研究构建了一种兼具高装载效率与良好安全性的sEV递送体系，不仅为RNA药物递送提供了新的技术路径，也为心血管疾病等慢性疾病的基因治疗提供了新的可能。
中山大学附属第八医院王慧杰、章小哲、华南师范大学梁韵军、中山大学附属第八医院曾泽楷为该论文共同第一作者，中山大学附属第八医院伍贵富教授、中山大学附属第一医院范文冬副研究员为该论文共同通讯作者。该研究获国家自然科学基金(82270437、82270477、82570526、81970367)、广东省基础与应用基础研究基金(2023A1515030110)、深圳市医学重点学科建设专项基金(SZXK002)、深圳市重点临床专科建设基金(ZDXKJF-01002)、深圳市科技创新委员会科研项目(JCYJ20250604142759031)以及深圳市医学研究专项基金(A2302012)的支持；并得到了华南师范大学刘智明研究员的支持与帮助。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X26002148