血液凝固（止血）是一个高度复杂且精细调控的生理过程，起源于数亿年前。凝血酶原酶（prothrombinase）是一种关键酶复合物，由凝血因子Xa（factor Xa, fXa）和凝血因子Va（factor Va, fVa）组成，催化凝血酶原（prothrombin）转化为具有活性的凝血酶（thrombin）。这一转化过程对维持血管完整性及防止出血至关重要。 在正常生理条件下，fXa对fVa的亲和力较低，且二者的有效组装及功能依赖于带负电荷的磷脂（phospholipid, PL）膜的参与，这种膜促进了复合物的组装并显著加速凝血酶的产生。然而，这种对磷脂的依赖性增加了结构研究的难度，限制了对凝血酶原酶复合物分子机制的深入理解。 有趣的是，一些蛇类进化出了一种高亲和力的毒液型fXa，可以在无磷脂条件下高效地激活凝血酶原。基于这一现象，本研究团队设计了一个包含17处突变的高亲和力人类fXa变体（M17），该变体能与fVa形成磷脂依赖性大幅降低的复合物，功能上等同于膜结合的野生型人类凝血酶原酶。

本研究旨在借助M17变体构建的高亲和复合物，利用冷冻电镜（cryo-EM）技术，以3.3Å的高分辨率解析人类凝血酶原酶的结构，明确fXa与fVa之间的相互作用界面，从而深化对凝血酶原酶组装与功能的分子机制理解。

研究团队表达纯化了野生型fXa、M17高亲和变体及缺失B域的fV。采用生物层干涉技术（BLI）测定M17与fVa的结合动力学，发现其亲和力显著优于野生型fXa。利用SDS-PAGE监测凝血酶原的裂解过程，验证M17-fVa复合物在无磷脂条件下也能有效催化凝血酶原转化。 随后，M17-fVa复合物被用于冷冻电镜样品制备，通过倾斜成像策略解决了颗粒取向偏向问题，最终获得3.3Å分辨率的重构图谱。结合AlphaFold预测模型、已知的蛇毒凝血酶原酶结构及本研究获得的fXa-a2肽段晶体结构，进行了模型构建与精修。

结果显示，fXa与fVa的主要接触界面涉及fXa的丝氨酸蛋白酶（SP）及EGF2结构域以及fVa的A2和A3结构域，整体结合面积约为4900 Ų。特别重要的是，fVa的A2结构域C端非结构化区域——a2环，与fXa的带正电的肝素结合位点（HBS）形成关键的抗平行β链相互作用。该a2环富含酸性残基及硫酸化酪氨酸，对复合物的稳定性和功能具有重要影响。 17处突变中，有12处显著增强了fXa与fVa的亲和力，主要通过提升界面电荷互补性实现，即增强fXa界面带正电荷的性质，促进与fVa酸性表面的结合。

凝血因子 Ⅹa 和凝血因子 Ⅴ 结构域组织示意图以及凝血酶原加工途径

此外，M17-fVa复合物能够在无磷脂膜的条件下保持高效的凝血酶原切割活性，显示出与膜结合的野生型复合物相似的功能特征。 本结构与先前蛇毒凝血酶原酶复合物结构高度一致，且与AlphaFold预测模型吻合良好。同时，本研究对比了之前报道的低分辨率人类凝血酶原酶冷冻电镜结构，指出此前结构中fXa位置及a2环构象存在显著差异，本研究结构因分辨率更高及结合多种证据，预计更准确地反映了生理状态下的人类凝血酶原酶构象。

M17 突变对凝血酶原酶组装及功能的影响

综上，本研究成功设计并解析了高亲和力的膜非依赖人类凝血酶原酶复合物结构，突破了因磷脂依赖性带来的结构解析难题。3.3Å的结构图谱详细描绘了fXa与fVa之间的关键相互作用，特别强调了a2环与fXa肝素结合位点的结合机制，为理解fVa的辅助因子功能提供了重要分子基础。 该成果不仅深化了对血液凝固过程分子机制的理解，也为抗凝药物设计提供了结构指导，尤其是在调控fXa-fVa相互作用方面，可能促进新型抗凝策略的开发。

原始出处

Üstok FI, Faille A, Huntington JA. A 3.3-Å cryo-EM structure of an engineered high-affinity human prothrombinase complex. Blood. 2025 Oct 27:blood.2025031527. doi: 10.1182/blood.2025031527. Epub ahead of print. PMID: 41144779.

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