DNA5-甲基胞嘧啶（5mC）是重要的表观遗传修饰，参与调控基因转录、基因组印记、表观遗传等多种生物学过程，是多个生物学领域的研究重点。5mC的异常甲基化模式与发育、衰老和癌症等多种疾病的发生发展密切相关。

亚硫酸氢盐测序（BS-seq）是5mC检测的金标准，但传统BS-seq存在DNA损伤严重、高GC含量区域转化不完全、高估5mC水平及处理时间长等不足，严重限制了其在低输入或碎片化样本中的应用。为了解决这些限制，美国芝加哥大学何川教授团队于2024年报道了超快速亚硫酸氢盐测序（UBS-seq），大大缩短了反应时间，提高了BS效率，减少了假阳性率和对5mC水平的高估。但DNA降解，特别是低输入DNA样本的问题，仍然是一个关键的挑战。

近日，何川教授团队在5mC检测领域再次获得突破，其团队在预印本bioRxiv报道了超温和亚硫酸氢盐测序（UMBS-seq）技术。UMBS-seq是一种检测5mC的方法，可以最大限度地减少DNA降解和背景噪声。当用于低输入量的DNA样本时，UMBS-seq在文库产量、复杂性以及转化率方面，均优于传统BS-seq和酶法甲基化测序（EM-seq）方法。该技术对低输入量的细胞游离DNA（cfDNA）以及基于杂交的靶向捕获具有较高的检测效率，这凸显了其在5mC生物标志物检测和疾病早期诊断等临床应用中的巨大潜力。

主要研究内容

研究团队改进了亚硫酸氢盐转化。传统BS-seq和EM-seq都依赖于未修饰的C转化为尿嘧啶（U），实现C和5mC之间的碱基分辨。亚硫酸氢盐介导的C转化高度依赖于亚硫酸氢盐浓度，浓度越高，转化效率越高。研究假设，在最佳pH值下最大化亚硫酸盐浓度允许的超温和条件的有效的C-U转化，从而最大限度地减少DNA损伤。为此，研究团队调整、确定了试剂KOH和亚硫酸氢铵的最佳配方：100μL 72%亚硫酸氢铵和1μL 20μM KOH，比此前的UBS配方表现出更高的转化效率（63.8%对55.6%）（图1b）。随后，研究确定了55°C 90分钟的最佳反应条件，并通过添加碱性变性步骤和DNA保护缓冲液进一步提高了亚硫酸氢盐的效率并保持了DNA的完整性。这一改进的亚硫酸氢盐配方和反应方案被命名为超温和亚硫酸氢盐（UMBS）转化。

图1.UMBS-seq在各项关键性能指标上均优于传统的酶法及BS处理方法。

片段大小分析表明，UMBS处理造成的DNA损伤明显小于此前的UBS方案。此外，用UMBS-seq和UBS-seq制备的文库比较表明，UMBS-seq在所有性能指标上始终优于UBS-seq，可产生更长的片段、更高的文库产量、更高的转换率、改进的GC覆盖均匀性和更准确的DNA甲基化估计。

为了更全面地评估UMBS-seq的性能，研究团队将其与传统BS-seq、市售亚硫酸氢盐试剂盒（EZ DNA甲基化金试剂盒）以及领先的酶替代品（NEBNext EM-seq试剂盒）进行了比较（图1c-f）。与传统BS-seq相比，UMBS-seq显著减少了DNA断裂。EM-seq和UMBS-seq在很大程度上保留了lambda DNA的完整性，EM-seq产生的DNA回收率明显较低。在5ng-10pg的DNA样本输入水平下，UMBS-seq始终产生更高的文库产量，表明DNA保存得到改善。与传统BS-seq文库相比，UMBS-seq文库显示出更高的复杂性（更低的重复率），并且性能优于EM-seq或与之相当。UMBS-seq的片段长度与EM-seq相当，比传统BS-seq的片段长得多。此外，与传统BS-seq相比，UMBS-seq在CpG覆盖均匀性方面有显著改善，仅略低于EM-seq。

在所有DNA输入水平中，UMBS-seq始终产生非常低的背景水平未转化C（~ 0.1%），即使在最低输入量下变化也很小。相比之下，传统BS-seq显示出较高但可接受的背景水平（<0.5%），EM-seq在较低输入（最低输入超过1%）下显示出明显较高的背景信号，并且三次重复之间的一致性较差（图1g）。值得注意的是，EM-seq容易出现假阳性，大部分未甲基化的C（7.6%）的未转化比率大于1%（图1）。

研究团队评估了UMBS-seq在临床中的5mC检测应用，在5ng-10pg的低输入样本量比较了EM-seq和传统BS-seq（图2）。在所有输入水平上，与EM-seq相比，UMBS-seq始终能产生更高的文库产量和更大的复杂性，同时qPCR Ct值更低，复制率更低。此外，生物分析仪电泳显示，在UMBS-seq文库中，较长的cfDNA片段的相对丰度更高，表明与传统BS-seq相比，DNA降解程度更低。值得注意的是，在插入片段大小分布方面，UMBS-seq的表现也与EM-seq相当。

图2.使用低输入量的cfDNA样本对UMBS-seq、EM-seq和传统BS-seq进行比较。

重要的是，UMBS-seq和EM-seq都表现出更好的基因组覆盖范围和更好的关键基因组特征表征，特别是在富含GC的调控元件中，如启动子和CpG岛。两种方法在较低的测序深度下都比传统BS-seq鉴定出更多的CpG位点，并且表现出更好的GC覆盖均匀性（图2e-f），从而更全面地分析CpG甲基化，减少假甲基化检测。与lambda DNA的分析一致，在所有测试的输入量中，与EM-seq和传统BS-seq相比，在稀疏甲基化的CHG和CHH位点上，UMBS-seq的背景甲基化水平较低。在CpG位点，EM-seq和传统BS-seq的甲基化水平相对被夸大，这表明由于其不完全转化，高估了甲基化水平（图2g）。值得注意的是，每种方法都准确重建了启动子区域和基因内5ng cfDNA的已知DNA甲基化模式。

研究团队进一步评估了UMBS-seq在疾病生物标志物发现中的潜力，实现了比EM-seq和传统BS-seq了更大的目标CpG位点覆盖率（图2h），强调了UMBS-seq在临床生物标志物应用中靶向甲基化分析的适用性和优势，特别是在处理具有挑战性的低输入cfDNA样本时。

以上结果表明，在多个关键性能指标上，UMBS-seq优于EM-seq，包括文库产量、复杂性、C-U转化效率，以及工作流程的简单性和鲁棒性。与传统BS-seq相比，UMBS-seq在所有评估参数上的性能都得到了显著提高。

结语

UMBS-seq代表了亚硫酸氢盐测序的重大进步。UMBS-seq最大限度地减少了DNA损伤和背景噪声，同时保持BS-seq的鲁棒性和效率。在简化的工作流程中，UMBS-seq在关键指标上优于传统BS-seq和无亚硫酸氢盐的EM-seq方法，包括文库产量、复杂性、转换率和信噪比。当与靶向捕获相结合时，UMBS-seq能够从低输入cfDNA中敏感和特异性地检测临床相关的5mC生物标志物。总之，UMBS-seq将亚硫酸盐化学的准确性与转化和临床应用所需的实用性相结合，从而推动BS-seq在临床领域的更广泛应用，将为5mC生物标志物的发现与检测树立新标准。

原文链接：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.10.09.681456v2.full

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