遗传代谢性肝病，作为肝脏疾病领域中的一个复杂且多样的分支，其诊断与治疗长期以来一直面临着诸多挑战。随着基因检测技术的进步、逐步普及应用，越来越多的遗传代谢性肝病得以诊断。近期，首都医科大学附属北京佑安医院郑素军教授分享遗传代谢性肝病的基因诊断，肝胆相照平台特将精华整理成文，以飨读者。

众所周知，遗传性肝病类型繁多。北京佑安医院郑素军团队联合解放军总医院第五医学中心张敏教授今年一项发表在《Journal of Clinical and Translational Hepatology》杂志上的研究表明，近十年（2013年-2023年），两所肝病专科医院遗传性肝病的诊断种类已从2002-2012年的15种显著增加至32种。许多此前在教科书中鲜有讨论的疾病，如今已逐步在临床实践中能时常见到，这无疑得益于基因检测技术的飞速发展。

01 基因检测的流程与原理

1. 全基因组测序

全基因组测序能够覆盖基因组中的所有基因区域，包括内含子、外显子以及基因间隔区。然而，该方法产生海量数据，给生信分析带来了巨大挑战，目前更多应用于科学研究。

2. 外显子测序

鉴于外显子承担着编码蛋白质及执行功能的关键职，虽仅占基因组的1%至2%，却包含了约85％的致病变异。外显子测序因其成本效益优势而成为目前应用最广泛的检测方法。

其流程包括样本采集、DNA片段化、接头连接、构建测序文库、特异性捕获探针富集外显子区域、PCR扩增及高通量测序等步骤。捕获探针的密度、覆盖范围直接影响检测结果。测序完成后将测序短序列（reads）与已知人类基因组序列比对，确定基因变异情况。

3. 外显子Panel测序：

针对特定临床表现，选取一组已知与该表型相关的基因的外显子区域进行测序，如针对黄疸这一临床表现，仅对与胆红素代谢相关的数百个基因的外显子进行测序。该方法提高了测序深度，降低了检测成本，。但panel包如果覆盖基因不全或更新不及时。可能会导致某种疾病或表型的新发现致病基因，由于尚未纳入panel包，从而导致假阴性结果而漏诊。

02 如何科学解读检测报告

在基因检测中，如何判断所发现的变异是否具有致病性，是后续面临的关键问题。目前，这一判断主要依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）和分子病理学协会共同制定的标准，将突变的致病性划分为五类，即致病性、可能致病性、意义不明、可能良性和良性。

这五类别的判定均遵循特定标准，例如，对致病机制为功能丧失（LOF）遗传性肝病来讲，无功能变异（包括无义突变、移码突变、经典±1或2的剪接突变、起始密码子变异、单个或多个外显子缺失等）是具有致病性的非常强证据（PVS1），此类突变会导致蛋白质表达异常或功能丧失。

在正常人群中未发现的变异、或出现频率极低的突变，新发变异（患者的新发变异，未经父母样本验证）往往提示可能有致病性，其致病性证据分类为中等证据（PM）。可在正常人群数据库中检索该突变，例如检索 dbSNP 数据库、外显子组整合数据库（ExAC，the Exome Aggregation Consortium）、NHLBI 外显子测序项目数据库（ESP，NHLBI Exome Sequencing Project）、千人基因组数据库等，评估其在人群中的出现频率。若该突变在正常人群中的频率超过 1%，通常被认定为多态性位点，其致病可能性较低，多为良性变异。

与既往已确定为致病性的变异有相同氨基酸改变的变异，为有致病性的强证据（PS1）。对于测序发现的变异，可查询与疾病相关的数据库，如孟德尔遗传数据库（OMIM）、人类基因组突变数据库（HGMD），以及临床变异数据库（ClinVar）等，以明确该变异是否已有文献报道与相关疾病存在关联。若存在明确报道，则增加该其致病性证据（图1）。

此外，还可借助多种生物信息学软件对变异的致病性进行预测，评估其是否可能影响蛋白质功能。通常会采用多种不同的软件进行综合分析（图2），若其中三种及以上软件提示该变异可能具有致病性，这一结果也会作为重要的参考依据。

图1. 基因变异致病性分析基本流程

图2. 相关数据库及预测软件

最后，还需判断这些突变是否与疾病的临床表现存在关联性，是否符合家系共分离原则。部分变异虽经预测显示具有致病性，但与患者的临床表现不相符，此类变异则可能并非真正的致病变异。只有对上述各项因素进行综合考量，才能作出准确的判断。

03 当检测结果为阴性时，我们应如何理性应对

接下来，结合具体病例说明如何解读基因检测报告，以及在面对阴性结果时的处理方式。

以一名儿童患者为例，其主要临床表现为低GGT型肝内胆汁淤积，据此极易考虑到遗传代谢性疾病。通过基因检测，发现该患者存在 ATP8B1 基因的纯合突变，该基因与胆汁酸合成障碍相关。尽管为纯合突变，但检测报告给出的结论为意义未明。意义未明意味着该突变可能具有致病性，也可能不具有致病性。尽管患者的临床表现与之相符，但报告的意义未明结论促使进一步分析。分析发现，在填写基因检测申请书时，未提供家族史信息（患儿姐姐幼年反复黄疸,也表现为GGT正常型胆汁淤积），而家族史高度符合某种单基因遗传病是变异具有致病性的支持性证据（PP4）。后续补充家族史并进行重新分析后，报告将该突变的致病性等级修正为可能致病，该类变异往往>90%有致病性，最终患者顺利诊断为良性复发性肝内胆汁淤积（BRIC1）。

由于生信分析常采用表型驱动分析的方法，重点关注受检者所提供的临床/家族病史信息相关基因，所以在填写基因检测申请书时，临床表型、家族史等信息的完整性、准确性至关重要。然而，许多医生可能因工作繁忙而忽视这一点，值得注意。

在解读报告的过程中，不仅要关注变异本身的情况，还需重视检测质量。部分机构提供的测序服务价格低廉，但可能在探针选用、测序深度等关键环节存在不足，进而导致检测结果不可靠。因此，需要关注 Q30（测序质量值）、捕获率（外显子捕获效率）、测序深度（每个片段的测序次数）等关键指标，这些指标可用于评估检测报告的可靠性（图 3）。

图3. 基因检测报告的报告质量

此外，还需要了解基因检测的技术特点。例如，外显子测序主要针对外显子区域，可能无法检测到内含子区域、基因间区域、线粒体突变或拷贝数变异等。需要了解这些局限性，并在解读结果时加以考虑。

当结果为阴性时，需保持理性与科学态度。阴性可能意味着：第一，患者的确无遗传性疾病；第二，现有技术未能捕获相关变异。此时可根据具体情况考虑其他方法补充，如CNV分析、线粒体测序、全基因组测序等。同时，定期关注数据库更新、新基因发现，必要时重新分析。临床中遇到以下几种情况即建议进行数据重新分析：

1）未明确诊断的阴性报告，仍怀疑为单基因疾病；

2）针对常染色体隐性遗传疾病，只发现与表型相关的一个变异；

3）检测报告提示与表型相关的变异类型为意义不确定变异（VUS)；

4）受检者出现新表型，或较之前报告的表型有新补充和关注的疾病方向；

5）家族内出现相同表征的患者。

04 小结

• 基因测序是诊断遗传代谢性肝病的有力工具；

• 基因测序申请单需标注准确表型，最好先证者及父母三人送检；

• 要了解测序原理、掌握常见结果解读方法；

• 二代测序也有技术缺陷，应正确应对阴性结果；

• 要重视数据重分析；

• 诊断不能片面强调基因测序，应强调临床思维为主导，临床-病理-影像-基因多角度支持，才能下诊断。

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