循环肿瘤DNA（ctDNA）的高灵敏检测是肿瘤早期筛查与疗效动态评估的重要技术支撑。然而，血液中ctDNA丰度极低（通常低于0.1%），传统检测技术普遍存在灵敏度不足、假阳性率偏高以及操作流程复杂等问题。近年来，基于CRISPR-Cas系统的生物传感技术凭借其精准靶标识别能力、非特异性反式切割活性及模块化编程特性，在核酸分子检测领域展现出极大的潜力，目前，CRISPR检测方案大多需要通过预扩增手段提升灵敏度，且天然Cas蛋白在复杂生物样本中易受温度波动、蛋白酶降解等环境因素影响而失活，限制了临床现有技术的转化应用。因此，在保持Cas蛋白稳定性的同时提升反式切割活性，成为提升ctDNA检测技术的新挑战。

近日，南京医科大学第一附属医院殷咏梅教授团队与南京大学/上海大学李根喜、张娟教授团队合作，提出了一种锰金属有机框架材料（Mn-MOFs）增强的CRISPR系统（MME-CRISPR），并进一步构建了电化学生物传感器用于ctDNA的灵敏检测。如图1所示，他们创新地以将定制化酶激活剂（Mn²⁺）与Cas12a/crRNA共组形成酶-MOF复合物，该复合物可以在温和条件下迅速释放。同时，MOF引发的邻近效应可以在释放过程中持续提供足够的Mn²⁺，充分促进与Cas12a/crRNA相互作用，从而增强Cas12a/crRNA的反式切割活性，而且该复合物还能够有效地保护Cas12a/crRNA免受各种外部刺激。因此，他们所开发的基于MME-CRISPR的生物传感器无需预扩增即可实现ctDNA的超灵敏检测。研究成果以“Enhanced the Trans-Cleavage Activity of CRISPR-Cas12a Using Metal-Organic Frameworks as Stimulants for Efficient Electrochemical Sensing of Circulating Tumor DNA”为题发表在Advanced Science上，殷咏梅、李根喜、张娟教授为论文的共同通讯作者，吴帅博士与博士生刘殷成为共同第一作者。

图1 基于Mn-MOFs增强的CRISPR-Cas12a传感体系用于ctDNA检测的设计原理。图片来源：Advanced Science

在该研究工作中，作者团队首先通过X射线衍射、扫描电子显微镜、元素分析、荧光标记成像以及傅里叶红外等手段对Mn-MOFs与Cas12a/crRNA共组装行为进行表征。如图2所示， Cas12a/crRNA能够高效地被包裹在Mn-MOFs材料当中。他们随后详细地研究了Cas12a/crRNA在不同pH下的释放行为，并通过测定Cas12a/crRNA@Mn-MOFs的酶动力学常数以及在各种条件下的活性变化，验证了酶的反式切割活性以及稳定性方面均有显著的提升。

图2 Cas12a/crRNA@Mn-MOFs的制备与表征结果图。图片来源：Advanced Science

作者团队进一步以表皮生长因子受体（EGFR）L858R突变为ctDNA检测目标，并基于MME-CRISPR建立了一种新型的电化学生物传感器用于ctDNA的分析，结果显示，该传感器的检测限可低至0.28 fM，灵敏度较传统方法提升2个数量级。

图3 基于MME-CRISPR的生物传感器用于EGFRL858R检测分析。图片来源：Advanced Science 

作者团队还设计了工程化的错配crRNA使得基于MME-CRISPR的生物传感器能够以高信噪比检测单核苷酸变异，并将该传感器初步应用于临床实践。如图3所示，该传感器能够以低剂量样本并在短时间内高效检测ctDNA靶标，且具有非常高的精确度，展现出巨大的临床应用潜力。此外，通过合理设计crRNA的结构，他们所研制的生物传感器还可以很容易地用于各种核酸靶点的检测分析，为癌症诊断、治疗和监测应用提供新的技术支持。

Tags： 殷咏梅/李根喜/张娟《Adv. Sci.》：MOF增强的CRISPR-Cas12a生物传感体系用于循环肿瘤DNA检测