光动力治疗(Photodynamic therapy, PDT)利用光敏剂产生高毒性活性氧来清除细菌，因其耐药性低而备受关注。然而大多数光敏剂只对革兰氏阳性菌有效，对革兰氏阴性菌的效果有限。这一局限性源于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间的膜结构差异，两者均有磷脂内膜，但革兰氏阴性菌特有的外膜由致密排列的脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)组成，因此外膜作为一个强大的屏障阻止光敏剂进入革兰氏阴性菌，极大的阻碍了PDT的抗菌效率。尽管有研究者通过设计带有一定正电荷或疏水性的光敏剂来增强光敏剂在细菌表面的富集，但由于活性氧的寿命极短及扩散半径较窄，仍然无法破坏细菌外膜结构，无法彻底根除革兰氏阴性菌。为了解决以上问题，南京大学甄叙、蒋锡群教授研究团队报道了一种对细菌外膜具有破坏作用的肽-光敏剂偶联物(Peptide-photosensitizer conjugate, PPC)，以增强对革兰氏阴性菌的PDT效率。研究结果表明，PPC能够有效破坏细菌外膜的结构完整性，从而有效地渗透到革兰氏阴性菌内部，在细菌内部产生大量活性氧，有效杀伤革兰氏阴性菌。

图1 PPC通过破坏细菌外膜增强对革兰氏阴性菌的光动力治疗示意图

PPC由亲水的阳离子短肽和疏水的AIE光敏剂(PS)组成。作者首先检测了PPC对以绿脓杆菌和大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌的抗菌效果，结果显示PPC能够在两种细菌表面产生孔洞，使细菌内容物流出，从而进一步聚集在细菌内部，白光照射下在细菌内部产生大量活性氧，在体外有效地将革兰阴性菌的存活率降至接近零。而PS虽然能够聚集在革兰氏阴性菌表面，但对两种细菌无明显杀伤效果，延长光照时间也无法引起细菌数量的显著变化。

图2 PPC对革兰氏阴性菌的体外抗菌机制研究。(a)PPC与绿脓杆菌和大肠杆菌共孵育后的共聚焦图片及(b)相应的强度曲线；不同处理后(c)细菌的形态变化、(d)上清中的核酸类物质含量变化、(e)细菌细胞膜通透性变化和(f)细菌内ROS生成情况。

鉴于PPC能有效破坏革兰氏阴性菌的细胞膜，为了进一步探索PPC与细菌细胞膜之间的相互作用位点，作者检测了PS对绿脓杆菌和大肠杆菌原生质体的杀伤效果，结果显示PS光照下对两种原生质体具有良好的杀伤效果，而对完整的绿脓杆菌和大肠杆菌几乎没有杀伤效果，证实了外膜在阻碍PDT对革兰氏阴性菌抗菌效果中发挥的关键作用。LPS是外膜的重要组成部分，其中脂质A分子通过静电作用被二价离子桥接中和，构成了致密、低渗透的外膜结构，而研究结果显示PPC能够有效破坏LPS聚集体，且外源性添加LPS和Ca²⁺/Mg²⁺能够抑制PPC的抗菌效果，表明PPC可能通过与Ca²⁺/Mg²⁺竞争结合脂质A，从而与LPS相互作用，导致LPS解离。此外，外膜是一个不对称的结构，外侧是LPS，内侧是磷脂小叶，而外源性添加磷脂酰乙醇胺/磷脂酰甘油能够抑制PPC的抗菌效果，说明PPC与LPS相互作用后，到达外膜的内侧对磷脂小叶产生干扰，最终导致革兰氏阴性菌外膜屏障的破损。

图3 PPC与革兰氏阴性菌外膜相互作用机制。(a)绿脓杆菌和(b)大肠杆菌原生质体与PS共孵育后在不同照射时间下的存活率；(c)不同处理后LPS聚集体尺寸分布；外源性添加LPS和不同阳离子后对(d)(f)绿脓杆菌和(e)(g)大肠杆菌存活率的影响；外源性添加磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺对(h)绿脓杆菌和(i)大肠杆菌存活率的影响。

最后，作者在小鼠绿脓杆菌感染创面/角膜炎中验证了PPC的光动力抗菌效果。光照下PPC处理后的小鼠背部创面愈合率高达92.2%，创面细菌数量降低约2个数量级，小鼠角膜感染症状得到缓解，眼部评分逐渐下降，角膜中残留细菌数量明显减少，PPC介导的光动力治疗成功治愈了绿脓杆菌引起的全层皮肤感染和角膜炎。

图4 PPC对小鼠绿脓杆菌感染创面/角膜炎的光动力抗菌作用：(a)不同处理后的小鼠背部创面愈合率；(b)不同处理后小鼠背部创面细菌计数；(c)不同处理后小鼠眼部评分；(d) 不同处理后小鼠眼部细菌计数。

该研究成果以“Membrane disruption-enhanced photodynamic therapy against Gram-negative bacteria by a peptide-photosensitizer conjugate”为题发表在ACS Nano。论文第一作者为南京大学博士生周文雅，通讯作者为南京大学甄叙研究员和蒋锡群教授。本研究工作得到国家重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、中央高校基本科研项目和江苏省自然科学基金项目的资助。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c05443

Tags： 南京大学甄叙/蒋锡群教授《ACS Nano》：肽-光敏剂偶联物破坏细菌外膜增强对革兰氏阴性菌的光动力治疗研究