糖尿病肾病(DN)是终末期肾脏疾病的主要死亡原因，占糖尿病患者病例的30%-40%。全球DN患病率呈上升趋势，极大地影响了很大比例的糖尿病患者。DN的特征是肾小球的结构和功能改变，肾小球是通过过滤废物和多余液体来净化血液的主要单位。肾小球损伤表现为肾小球基底膜增厚和肾小球细胞肥大，导致蛋白尿，最终导致DN的发病机制。

以细胞增殖永久停止为特征的细胞衰老与慢性肾脏疾病(CKD)和急性肾损伤的进展有着复杂的联系。Coresh等人强调65岁以上的人群中有15-38%患有CKD，而85岁以上的人群中这一比例上升到50%。糖尿病患者中年龄相关肾脏疾病的发展与肾小球病变密切相关，如肾小球硬化和足细胞损失。衰老肾脏的宏观结构变化包括皮质体积减小，表面粗糙度增加，这与肾小球硬化的典型微观结构特征相对应。

越来越多的证据表明，DN与肾小球足细胞和系膜细胞的加速衰老高度相关。然而，必须认识到细胞衰老是一个由多种因素形成的多方面过程，其对DN的确切影响有待于更深入的研究。在这项研究中，我们采用了生物信息学与机器学习相结合的协同方法来发现与细胞衰老和肾小球相关DN相关的重要基因。随后的实验验证确定了三个特征基因。治疗针对肾小球内的细胞衰老及其相关途径可能提供一种有希望的途径来减轻甚至停止DN的进展。

方法:分别从Gene Expression Omnibus (GEO)和CellAge数据库中获取肾小球相关DN数据集和细胞衰老相关基因。通过整合生物信息学和机器学习方法，包括LASSO回归分析和随机森林，我们筛选出了四个特征基因。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价所选基因的诊断效能。随后在小鼠模型中进行了严格的实验验证，以证实三个特征基因LOX, FOXD1和GJA1的鉴定。进一步建立与绿原酸(chlorogenic acids, CGA)的分子对接，不仅验证了LOX、FOXD1和GJA1作为诊断标记，而且揭示了它们潜在的治疗作用。

详细的数据集信息

本研究流程图

DEGs的鉴定与富集分析。(A) DN组与对照组之间DEGs的火山图。红点代表上调基因，蓝点代表下调基因。(B)温度热图。横轴表示样本类型，纵轴表示基因组之间的表达差异。(C) DEGs基因集富集分析。(D) GSEA脊图，显示了top GO项的NES值。

DESRGs热图及相关分析。(A)热图显示DESRGs的表达。(B) DN组DESRGs相关网络图。(C) DN组DESRGs相关热图。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。

DESRGs的GO和KEGG分析以及PPI网络的构建。(A)与DESRGs相关的生物过程(bp)、细胞成分(CCs)和分子功能(MFs)。(B)由DESRGs富集的KEGG通路。(C)富集基因、GO项和KEGG通路的和弦图。(D)细胞衰老相关DEGs的PPI网络。

应用机器学习算法进行特征基因的选择。(A) LASSO回归分析所得系数。不同的颜色代表不同的基因。(B) LASSO算法筛选的特征基因。(C)射频算法的精度。(D) RF算法筛选的前20个基因的重要性排序。平均准确率在重要性和基尼指数上下降。(E) LASSO与RF筛选结果相交的维恩图。

估计特征基因诊断效能的ROC曲线。(A-D)训练队列GSE30122中FOXD1、LOX、GJA1和BTG3的ROC曲线。(E-H)试验队列GSE1009中FOXD1、LOX、GJA1和BTG3的ROC曲线。(I-L)试验队列GSE104948中FOXD1、LOX、GJA1和BTG3的ROC曲线。

选择的特征基因在DN小鼠实验中的验证。(A)实时荧光定量PCR (q-PCR)分析鉴定基因在DN小鼠模型匀浆肾脏组织中的mRNA表达水平(n = 9-15)。采用t检验进行统计学分析，以确定对照组和DN组之间存在显著差异。(B)相关散点图显示肾脏中鉴定的关键基因与Kim-1 mRNA表达水平之间的关系，采用Spearman秩相关(R)。(C) Western blot分析均质化DN小鼠模型肾脏组织中相关基因的蛋白表达水平(n = 4)。采用Student 's t检验进行统计学分析，以确定对照组与DN组之间的显著差异。

CGA与GJA1、LOX和FOXD1相互作用的分子对接结果。(A, B) CGA与GJA1的分子对接构象。(C, D) CGA与LOX作用的分子对接构象。(E, F) CGA与FOXD1作用的分子对接构象。

Tags： Front Immunol：南方医科大学基于细胞衰老的肾小球相关性糖尿病肾病潜在诊断标志物和治疗靶点的综合分析