目前的癌症免疫疗法（免疫检查点抑制剂+CAR T细胞疗法）在儿童癌症中展现出不同程度的缓解率，识别生物标记，特别是识别免疫标志物对于病患分层变得极其重要。然而，当前大多数肿瘤免疫微环境和生物标记识别的研究都集中于成人实体瘤，对儿童实体瘤相关的分析则相对欠缺。

近日，来自加拿大和德国的学者联手合作在 Genome Medicine 上发表了题为 Transcriptional immunogenomic analysis reveals distinct immunological clusters in paediatric nervous system tumours 的文章，详细描述了作者对一系列儿童神经系统肿瘤（pedNST）的多细胞批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据集的免疫基因组分析结果。

这些RNA-seq数据集来自CBTN（n=581），TARGET（n=149），ICGC（n=195）三个公用数据库，覆盖了共925例中央或周围神经系统的儿童肿瘤样本。作者同时还加入了79例异种移植（patient-derived xenograph, PDX），以及TCGA中常见的几种成人肿瘤样本（n=2452）作为对照。作者首先分析了这些儿童神经系统肿瘤样本的免疫渗透率，即bulk RNA-seq结果中免疫相关基因测序读数的百分比（immune read percentages），结果显示免疫渗透程度在不同样本间呈现很大差异，但总体与成人中枢神经肿瘤的渗透率相差不大。由于免疫渗透在同一种癌症类型中也展现了显著差异，作者决定通过基因表达强度而不是肿瘤类型来对样本进行分类。

作者采用聚类的方法，通过3041个免疫相关基因的富集得分对所有pedNST样本进行分组，最后得到四个免疫集群。这四个集群分别是Paediatric Inflamed（炎症型），Myeloid Predominant（髓系主导型），Immune Neutral（免疫中性型）和 Immune Desert（免疫荒漠型），其中超过半数的pedNST样本都属于“冷肿瘤”，微环境中免疫细胞信号很少。作者发现，免疫信号更低的集群Immune Neutral和 Immune Desert总生存率低于其他两组，并推断这两组集群的样本免疫识别率相对更小。

pdNST肿瘤类型与来源分布；各样品及对照组的免疫渗透率；基于3041个免疫相关基因表达量的聚类结果

作者下一步对四个免疫集群的基因表达作了更进一步分析，发现免疫相关通路（例如IFN-α，IFN-γ）在Paediatric Inflamed和Myeloid Predominant两组中表达信号更强。其中各种免疫细胞的标志基因在Paediatric Inflamed组中有显著信号增强，例如B细胞标记JCHAIN，MZB1，CD79A，巨噬细胞标记MARCO和粒细胞标记ADGRG3，FPR2。像PDCD1，CTLA4，FOXP3等免疫抑制相关的基因在Paediatric Inflamed中的表达也高于其他三组。而Immune Desert则显示更活跃的细胞增殖水平，同时还有LAG3基因表达的增强，作者因此建议未来可以进一步验证LAG3在部分pedNST中的作用。

各个免疫集群与剩余样本的基因差异表达火山图

考虑到肿瘤突变负荷（TMB）已经被FDA认可作为成人癌症的生物标记，作者接下来的评估是四种免疫集群间是否存在TMB的差异。然而无论是每个Mb的SNV数（SNV/Mb），还是每个Mb的SNV+Indel数（SNV+Indel/Mb），都没有显示在四个集群间的显著差异，说明TMB至少对大多数pedNST来说并不是一个合适的免疫生物标记物。总体来说，肿瘤内部的基因组变异与免疫微环境的关联目前还不是很清晰。

此外，作者用CapTCR-seq方法从bulk RNA-seq数据中提取了pedNST样本的T细胞受体b（TCRb）序列，并计算了样本TCRb序列的Shannon多样性指数。他们发现，Paediatric Inflamed集群的T细胞库（T cell repertoire）多样性显著增高，作者还推断T细胞克隆的扩增可能源自与抗原呈递细胞的相互作用。作者还对B细胞库做了类似的分析，发现Paediatric Inflamed集群的B细胞克隆扩增也高于其他集群。

四个免疫集群的T细胞库多样性与B细胞克隆扩增对比

最后，为了进一步识别pedNST样本的免疫细胞亚型，作者用单细胞RNA测序得出的免疫细胞亚型标记基因对样本进行了新一轮聚类。结果显示，Paediatric Inflamed集群中存在五个不同的T细胞亚型，其中两个亚型（TG2/TG3）富集初始（naïve）T细胞，而TG4/TG5亚型则富集已分化T细胞。而对Myeloid Predominant集群的聚类则揭示了两个主要的分型，富含肥大细胞、巨噬细胞和单核细胞的MG1以及富含浆细胞样树突细胞和肿瘤相关巨噬细胞的MG3。

综上所述，在该项研究中作者通过聚类分析揭示了pedNST样本的四种免疫微环境集群，它们各自的基因表达特征，B、T细胞库多样性以及免疫细胞亚型构成。同时，作者没有观察到免疫渗透率与肿瘤突变负荷的关联，说明成人肿瘤的生物标记物可能并不适用在儿童实体瘤的病例中。

Tags： Genome Med：儿童神经系统肿瘤的免疫基因组学分析