临床病史

患者男，58岁。4月前患者无明显诱因出现恶心，呕吐等神经系统症状，伴左侧肢体无力，为求诊断，三次住院治疗，头颅CT、MRI等均提示脑梗塞等影像学改变，给予常规神经内科治疗，效果不佳。

考虑到既往病史：4年前发现“左肺恶性肿瘤”，术后口服靶向药及化疗，3年后出现“骨转移”。患者反复出现神经系统症状，常规治疗效果欠佳，虽然影像学未提示明显脑转移，仍不能排除在影像学范围内无法发现的微小转移，遂行腰椎穿刺术，并寄希望于病理科，希望通过脑脊液检查能发现什么蛛丝马迹。结果如下所示：

（图）脑脊液细胞学正常情况下细胞量很少，以少量淋巴细胞、单核细胞为主，高倍镜下（HE， X40）此患者少量细胞中查见单个核大、深染细胞（与旁边正常淋巴细胞内对照），核染色质粗糙，核膜稍不规则，核浆比倒置。

反向论证，常见的细胞恶性肿瘤中鳞状细胞癌，细胞核染色质更加粗块状，核膜不规则更加明显，此单个细胞看起来相对“温和”。此单个细胞也无小细胞癌的椒盐状染色质，可排除。正常脑脊液中可有少量淋巴细胞、单核细胞，是血脑屏障中的“警察”，具有趋化作用、吞噬作用和杀菌作用，能吞噬病原微生物，清除异物、衰老红细胞和抗原-抗体复合物等，这个视野也能看见一个“孤守”在这里的淋巴细胞，然而，这个防御细胞在肿瘤细胞面前显得是多么的渺小和无助，个子那么小，肿瘤细胞个子又这么大，“打也打不过”，“吞也吞不下”，无可奈何......，所以恶性肿瘤诊断明确，结合临床病史，考虑肺腺癌转移。

但病理诊断可是金标准，这样单个的细胞下死刑判决书可是得千万慎重，为了能够万无一失，最好能免疫细胞化学染色二次验证，保证病理报告准确性的二重保险。

由于脑脊液是所有细胞学中细胞量最少的，无法进行细胞蜡块制做，即使用琼脂包埋也无法让单个的几个细胞成蜡块制片。虽面临“巧妇难为无米之炊”的困境，但病理探索无止境，为了进一步寻求证据，给患者一个明确诊断，将液基细胞学唯一的片子褪色，进行免疫细胞化学染色，结合临床病史，选特异性最高的TTF-1，结果如下：

TTF-1免疫细胞化学染色显示所有HE染色中怀疑的单个细胞核均呈阳性表达。

结合临床肺腺癌病史、形态学及免疫细胞化学染色，最终病理诊断：（脑脊液）结合形态及免疫细胞化学染色，符合肺腺癌转移。

有了免疫细胞化学染色蛋白层面的二次支撑，病理诊断书签字也能够信心十足，下面的治疗预后的接力棒就该交给临床医生了。

讨论

临床表现上，由于肿瘤细胞在软脑膜中的播散，导致脑脊液循环受阻，因而产生颅内压增高以及大脑脑膜损害等相应表现，但是表现并不特异，如：头痛、恶心、呕吐、视觉障碍、听力损失和神经认知障碍等。

但在影像学方面，目前具有脑膜转移症状阳性的患者中，影像学阳性率不足20%，并且值得关注的是，脑膜转移癌影像学一经确诊提示预后极差。本例患者三次影像学报告均无明显阳性表现，但在少有的脑脊液细胞中查见极个别单个散在的异型细胞，液基瓶中残留液体无法再次制片及包埋，故通过对仅有的细胞褪色后证实为肺腺癌细胞转移至脑脊液。

脑脊液细胞学检查是脑膜转移癌诊断的金标准，但脑脊液细胞量少，且提取困难，脑脊液细胞学阳性率一直较低。目前认为脑脊液样本量是影响细胞病理学检测的重要因素，并且良好的制片辅助是可以辅助提高脑膜转移癌的诊断。对于提高脑脊液细胞学阳性率，薄层液基细胞学技术已在大多数检测细胞学标本泛使用，它具有更高的细胞回收率和更好胞保存作用，残留液体也可在如免疫细胞化学评估和分子中继续应用。假如液基细胞学量也极少，无法再次成片进行免疫细胞化学染色，还可对原切片进行褪色再次标记目标细胞协助诊断，本例异型细胞量极少，就采用此方法诊断明确。

脑循环有血脑屏障，一旦发生脑膜转移预后极差，在影像学确诊率极低的情况下，脑脊液细胞学明确诊断，对临床意义重大。患者意识淡漠5个月后意识丧失，重度昏迷，抢救无效，放弃治疗、死亡。一旦出现肿瘤脑膜转移,临床应予以高度重视，患者生存期短、预后差。

细胞蜡块在非妇科细胞学中意义重大，制做良好的细胞蜡块是免疫细胞化学诊断的基础。胸腹水细胞蜡块技术相对成熟，遇到像尿液、肺泡灌洗液、脑脊液等样本量极少的情况，琼脂细胞蜡块技术也可辅助成片进而应用免疫技术明确，但遇到这种仅有个位数异常细胞的情况，液基细胞褪色再免疫染色技术，也能给出临床最精确的诊断。

本病例较为典型且少见，是取材样本种类的极限，样本特性决定细胞量的稀少，对于细胞学诊断来说是挑战，因为它很难有组织学印证。有挑战就有机遇，关键在于战法。褪色后复染免疫细胞化学的确是一个很不错的方法，在条件有限的情况下是值得推广的。故整理思路供广大病理工作者参考。

脑脊液制片及免疫细胞化学染色制作方法

1.脑脊液穿刺：

腰椎穿刺术，脑脊液单次采集标本量1～2 ml；

2.液基薄层甩片法制片：

将脑脊液全部加入液基细胞制片仓内，以1250转/min离心5分钟，将脑脊液中的细胞全部甩至载玻片（粘附胶片，保证褪色过程中细胞不丢失）上；

3.固定：

离心完成后将含有细胞的载玻片立即放置95%乙醇固定15 min；

4.染色：

HE细胞染色。

5.诊断：

阅片确诊病变后，需要做免疫细胞化学染色。

6.扫描切片：

为了将HE切片保存完整，利用切片扫描仪（x40）进行切片扫片，保留原HE切片图像；

7.褪色：

因为脑脊液细胞量很少，无法重新制片，只能将原来HE切片褪色重新染免疫组化；

褪色方法：

（1）将原HE切片放置二甲苯中静置，直至盖玻片松动，轻轻去下盖玻片再将载玻片放置二甲苯缸内静置10min，脱去切片上的封片树胶。

（2）将二甲苯中的切片取出放置在新的二甲苯缸中，洗去多余的树胶，将切片树胶脱干净；

（3）将带有二甲苯的切片放置在无水乙醇中，洗去切片中的二甲苯，此步骤可以重复两次，直至二甲苯洗干净；

（4）将切片静置在95%乙醇中10minx2次，脱去切片中的伊红；

（5）将切片静置在85%乙醇中10minx2次，脱去切片中的伊红；

（6）将切片静置在75%乙醇中10minx2次，脱去切片中的伊红；

（7）水洗1min，洗去乙醇；

（8）将切片放置在盐酸分化液（1%盐酸）中，脱去苏木素，边褪边看，直到切片中无色为止；

（9）水洗，晾片，切片晾干为止。

8.免疫细胞化学染色：

（1）烤片：切片在55℃烤片机上烤片45分钟，细胞免组不用脱蜡，将切片放置蒸馏水中浸泡待用；

（2）修复：将切片放在装有EDTA抗原修复液内（PH9.0）的锅内，液体为沸腾状态，盖上锅盖，继续加热20min，时间到以后将锅从电磁炉中取下，放置在室温环境下冷却，锅内温度低至室温后取出切片；

（3）水洗：用免疫组化笔在玻片上圈出细胞区域，用PAS缓冲液清洗3次；

（4）封闭：3%过氧化氢水溶液处理10min，灭活内源性过氧化物酶的活性；

（5）一抗：在圈内滴加一抗TTF-1 100微升，室温静置1h；

（6）水洗：用PAS缓冲液清洗3次；

（7）二抗：在圈内滴加二抗100微升，室温静置20min；

（8）水洗：用PAS缓冲液清洗3次；

（9）显色：滴加DAB显色液100微升，静置5min；

（10）水洗：用PAS缓冲液清洗3次；

（11）复染：常用苏木素复染5-10s即可

（12）复染后自来水清洗数秒；

（13）脱水、透明、封片。

注：

• 因细胞片是自然风干，一定注意烤片时间及温度。

• 不能使用高压修复，防止掉片。

• 本次实验还有不够完美的地方，TTF-1是核着色，但免疫细胞化学染色胞浆液有着色，我们考虑少量非特异性着色，对于如何消除或减弱泛染现象，分析具体原因有三个可能：

  （1）3%过氧化氢水溶液处理时间不足，未完全灭活内源性过氧化物酶的活性；

  （2）加一抗时，抗体浓度稍高；

  （3）室内温度超过25摄氏度。

  仅供各位病理工作中参考，避免出现类似情况。

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