在微生物检验操作过程中，要保证检测环境（如超净台、检测室）以及所用工器具的洁净程度，同时保证人员各种操作的规范性，尽量保证其无菌性，防止因人为原因操作失误而出现误差结果，同时在适宜温度进行培养，为合理决策和指导生产提供依据。为保证检测结果的准确性，我们应做好以下几个方面：

培养基的灭菌及使用

1.每次配制时，要注意其生产日期是否在保质期内，查看其开瓶日期及瓶口密封性，保证其未变质，并且未吸潮。

2.培养基配制时，称量要准确，包括盐水的分装要准确。

3.一定要保证现配制现灭菌，未灭菌的配好培养基不能长时间放置，更不可隔夜。

4.灭菌时要保证恒温、恒压，同时要保证有效的灭菌时间。

5.灭菌过的培养基要冰箱保存，可保存一周，一般不超过3 天。而且要遵循“先入先出”原则，先配制的要先使用。

6.在使用时，要根据当班次的使用量，用水浴锅先将培养基溶化为液态，然后及时调低水浴温度（先化好的可从水浴取出，放在水浴锅锅盖上）待用，千万不可长时间使培养基处于高温状态。

7.做产品微生物检测时，倾倒培养基温度在45℃左右，不可过烫，避免将菌烫死；也不可过凉，化好的培养基又结块凝固，不便于观察结果。

8.每瓶培养基均要做空白。

9.尽量集中做样，避免频繁打开同一瓶培养基瓶塞，增大培养基的污染几率，出现误差结果。

10.培养基剩余过少时，可先将其倾倒成空白用板。

11.高压蒸汽灭菌器灭菌效果验证一般有化学指示剂法、留点温度计法、自制测温管法和生物指示剂法。如，化学指示剂法。化学指示剂在一定温度与作用时间下，会受热变色或变形，根据这一特点来判断是否达到需要的灭菌参数。一般实验室常用的是3M压力灭菌指示胶带，这种指示胶带是利用灭菌前后胶带颜色变化来判断灭菌效果。

检测环境的维持

一、大环境

检测室：

1.检测时，窗户和空调要关闭，或用酒精对房间进行喷雾消毒，避免房间内空气流通影响超净台内部环境（最好在有通排风系统的恒温恒湿无菌间进行操作）。

2.如果在原来的原料微生物检测室进行检测，要定期开启紫外灯，对房间进行杀菌。

无菌室：

1.洁净室（无菌室）是微生物检测的重要场所与最基本的设施。它是微生物检测质量保证的重要物质基础。因此它的设计要按国家标准《洁净厂房设计规范》、国家药品监督管理局颁发的《药 品检验所实验室质量管理规范（试行）》中第十八条规定执行。微生物实验室洁净室的施工、安装、验收应按国家行业标准《洁净室的施工及验收规范》执行。对于微生物检测工作者和使用管理者来讲，更大量的工作是进行正常管理到日常的使用。洁净室（无菌室）的标准要符合GMP洁净度标准要求。

2.洁净室（无菌室）要符合规范要求：无菌室应采光 良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。面积一般不超过10m²，不小于5m²；高度不超过2.4m。由1—2个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间和缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18-26℃，相对湿度45%-65%。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板 内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（2-2.5w/m³），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达40uw/m²。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。

二、小环境（超净工作台）

1.定期清洁初效过滤器，要及时更换。

2.检测前，将超净台内部进行清洁，用75%酒精进行擦拭消毒，并提前半小时将超净台紫外灯打开，对超净台内部环境进行杀菌。

3.关紫外灯，开风机，调整合适进风量，风量不可过低。

4.每次检测后，要对超净台内部进行清理、清洁，并用75%酒精进行擦拭消毒。

5.紫外灯根据其使用寿命要及时更换。

6.检测同时，要做上相应菌落检测的环境空白。

7.检测区域的选择：

a、一般在距离超净台外沿的1/3-2/3区域进行无菌操作；

b、要在酒精灯火焰的外焰保护区域进行操作。

工器具的洁净度

1.玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌。

2.检测用剪刀、勺子等物品要做到检测专用，不可与其它操作器具混用，使用时，先用75%酒精消毒，再采用灼烧方式进行灭菌。

3.接种针（环）采用灼烧方式进行灭菌，但要注意检测时要先将接种针（环）进行冷却。

样品的采集及检测

一、保证采样器具的无菌性

1.玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌，保证恒温、时间足够（但不可时间过长，容易导致玻璃器皿易裂纹而报废）。

2.取样筐：使用前要用75%酒精进行喷洒消毒。

3.取样勺：要保证其清洁消毒，清洁后用75%酒精进行擦拭消毒。

4.取样袋：可先用酒精进行擦拭消毒，再在超净台用紫外灯照射消毒，（包装车间要在传递窗用紫外灯照射消毒）。

5.电子称表面用75%酒精消毒。

二、人员操作

1.保证手部的清洗、消毒：取样前及检测前都要先洗手再消毒。

2.取样要具有代表性（随机样、目的样、综合样）且要标示清楚。

3.取样完毕，不可在车间逗留，要及时将样品放入超净台，对其外表面进行紫外灯照射消毒。

4.在要求的检测区域进行操作。

5.检测前，要用75%酒精棉球对样品袋口部进行擦拭消毒，再开口。

6.往盐水瓶加样品时，要注意勺子或袋子尽量不接触瓶口。

7.样品计量要准确，稀释倍数也要准确（1mL吸管不允许将管口敲掉），进行100倍稀释时，1mL吸管要伸入盐水中，不可以将样品从管壁流下去，同时要避免将管底部捅破。

8.盐水温度以40℃左右为宜，不能过热，会将部分微生物烫死；也不能温度太低，不能将样品溶解完全。

9.进行稀释时，要摇匀，保证溶液的均一性。

10.倾倒平皿时，要注意培养基瓶口不要接触到平皿；倾倒的培养基要适量，不可以太少，在培养过程中易干掉，微生物亦死亡，以15mL左右为宜。

11.做大肠菌群样时，要提前将乳糖胆盐培养基培养管按需要量备好，放入超净台对外表面进行紫外线灭菌。

12.接二步时，要注意先将接种针（环）进行冷却，避免出现接不上菌落的情况，导致无法判断、确认。

13.检测完毕，及时放入相应培养箱进行培养，并清理清洁超净台。

微生物的培养

1.在培养过程中，要随时监控培养箱温度，保证其在适宜的温度进行培养。

2.要按照《微生物检验规范》要求及时观察结果，出现异常，要及时分析原因进行反馈。

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