能量是维持生命系统复杂性及有序性的基础，作为具有独立基因组DNA的半自主细胞器，线粒体是包含人类在内的几乎所有真核生命的能量代谢中枢。在衰老过程中，线粒体的功能显着下降并导致细胞能量代谢稳态失衡，进而促进衰老及相关疾病的进程。但伴随衰老进程线粒体功能下降的核心原因尚未有明确定论，其中一个重要假设即是：伴随着衰老进程线粒体DNA（mtDNA）突变会不断累积，而由于mtDNA编码了线粒体氧化磷酸化所需的部分核心蛋白，因此mtDNA突变积累到一定程度后可导致线粒体及细胞功能的异常，促进衰老及相关疾病的发生。

由于mtDNA突变具有高度的细胞间异质性，而传统的混合细胞测序（Bulk sequencing）技术会导致单个细胞中的高频突变被平均化而无法被测到，极大地限制了我们对于细胞中mtDNA突变频率和突变谱的认识。因此，开发相应技术以在单细胞层面探究mtDNA突变与个体细胞衰老及相关疾病的关系尤为重要。

近日，康奈尔大学顾正龙教授（现就职于复旦大学和粤港澳大湾区精准医学研究院（广州））团队，在 PNAS 发表了题为：High-frequency and functional mitochondrial DNA mutations at the single-cell level 的研究论文。

该研究通过使用自主开发的低成本的单细胞mtDNA深度测序技术（scSTAMP，多重探针靶向扩增的单细胞mtDNA测序）对健康老年个体的B淋巴细胞及单核细胞进行单细胞mtDNA深度测序，首次揭示老年个体体细胞中mtDNA突变具有远高于预期的高频性、有害性及异质性，为衰老过程中线粒体功能下降现象提供了新的机制解释，并为衰老及相关疾病的干预及治疗提供了新的研究方向。

为更准确地评估细胞内mtDNA突变率及其对细胞功能的影响，研究团队首先基于基于前期自主开发的STAMP (Sequencing by Targeted Amplification of Multiplex Probes) 技术，开发了低成本的单细胞mtDNA靶向测序技术（scSTAMP）。基于该技术平台，研究团队获取了同一受试者的24 个B淋巴细胞（代表淋系）和24个单核细胞（代表髓系），将其裂解液分成两份，分别进行文库构建及深度测序，发现两者之间的突变谱具有高度的一致性，成功验证了scSTAMP技术检测单细胞水平mtDNA突变的可靠性。

单细胞mtDNA靶向测序技术（scSTAMP）的技术原理

为进一步系统探究老年个体细胞中mtDNA的突变图谱，并评估mtDNA突变对细胞功能的潜在影响，研究团队运用scSTAMP技术对来自一名76岁捐献者的各768个B淋巴细胞及单核细胞进行了超高深度（平均测序深度大于640×）mtDNA测序。研究团队在这些B淋巴细胞的416个mtDNA位点中鉴定到了473个突变频率超过20%的突变，而在这些单核细胞的439个mtDNA位点中鉴定到了503个突变频率超过20%的突变，平均每个B淋巴细胞和单核细胞中存在0.658个和0.712个高频mtDNA突变位点。

进一步分析发现，318个（50.3%）B淋巴细胞及346个（56.1%）单核细胞中至少具有一个高频mtDNA突变（>20%）。有趣的是，绝大多数B淋巴细胞（93.8%）和单核细胞（90.2%）中检测到的mtDNA突变位点都只出现了一次，说明老年个体体细胞的mtDNA突变具有高度的细胞间异质性及随机性。同时，还发现24.3%的B淋巴细胞和17.5%的单核细胞具有至少一个突变频率高于90%的高频突变位点。上述结果表明，高频mtDNA突变在衰老个体的B细胞和单核细胞中广泛存在。

B细胞和单核细胞中存在广泛的mtDNA突变

在上述研究基础上，研究团队对鉴定到的单细胞mtDNA突变进行了深入研究，发现90%以上的mtDNA突变均定位于蛋白编码基因及tRNA基因区，且定位于蛋白编码基因的mtDNA突变中，绝大部分（>75%）均为非同义突变。为进一步评估上述mtDNA突变的有害性，研究团队利用CADD (The Combined Annotation Dependent Depletion scores）数据库，发现B细胞中的52.2%的错义突变及单核细胞中59.6%的错义突变的分值均大于20，表明这些mtDNA突变具有较高的致病性，提示细胞内广泛的mtDNA突变有可能显着影响线粒体的功能，促进细胞及个体的衰老。文章还比较了两种细胞之间的突变差异。

B细胞和单核细胞中单细胞mtDNA突变功能分析

总而言之，该研究成功开发了低成本的单细胞mtDNA测序技术，并基于该技术绘制了老年个体的B细胞及单核细胞的mtDNA突变谱，发现老年个体的体细胞中mtDNA突变极为普遍，且具有高度的异质性及有害性，为衰老过程中线粒体功能下降的原因提供了一种新的机制解释。这一研究也提示mtDNA突变及衍生的线粒体功能下降是衰老及相关疾病的重要基础，而降低细胞mtDNA突变积累可能有助于衰老及相关疾病的预防及治疗。

顾正龙教授，国际知名遗传学家，现任粤港澳大湾区精准医学研究院助理院长、线粒体遗传与健康研究中心主任、复旦大学特聘教授。1998年获得北京大学学士学位，2003年获得芝加哥大学博士学位。2006年于康奈尔大学任教，2018年晋升为终身正教授。获得多项NIH、NSF等资助，荣获华盛顿国际生命研究院 2011 年“营养学未来领袖”奖。在多种顶级国际学术期刊上发表文章逾60余篇，包括 Nature、Nature Genetics、PNAS、Genome Research、FASEB、MBE、JBC 等，引用总计超4800次。

原始出处：

High-frequency and functional mitochondrial DNA mutations at the single-cell level. PNAS，2023.

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