深度解析医学证据，lxfs.net为你支撑决策

背景介绍

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，患者通常在症状出现后2-5年内因呼吸衰竭而死亡。约10%的ALS为家族性，其中10-20%由人超氧化物歧化酶1（hSOD1）基因的常染色体显性突变引起。突变型hSOD1蛋白构象不稳定、易聚集，通过氧化应激、线粒体功能障碍、内质网应激、轴突运输障碍和自噬紊乱等多重途径导致运动神经元退行性变。更为复杂的是，突变hSOD1在星形胶质细胞、小胶质细胞等非神经元细胞以及骨骼肌等外周组织中的表达同样加速疾病进展。目前，SOD1-ALS领域已有反义寡核苷酸药物Tofersen获FDA批准，但其需反复鞘内注射，且临床试验未达到改善疾病进展的主要终点，患者依从性和安全性均面临挑战。因此，开发一种单次给药、持久有效、兼具中枢和外周沉默效果的新型疗法具有迫切的临床需求。

研究思路

针对上述挑战，马萨诸塞大学谢君教授、高光坪教授、Xu Zuoshang教授团队开发了一种工程化AAV9基因沉默载体。该载体携带由人SMN1基因启动子驱动的双人工微RNA（amiR），靶向人SOD1基因。研究团队在载体设计中引入了多项创新：（1）采用双amiR设计——两个amiR共享相同的向导链，但分别嵌入小鼠和人miR-33支架中，以最大化单载体基因沉默效率，同时降低载体生产过程中发夹结构和直接重复序列引起的基因组截短风险；（2）采用人SMN1内源性启动子，其在CNS中高效驱动转基因表达，且已在SMA基因治疗中被验证安全有效；（3）包装为AAV9血清型，可通过静脉注射实现中枢神经系统和外周组织的广泛转导。在SOD1G93A ALS小鼠模型中，团队在疾病不同阶段（无症状期第60天、近发病期第90天、症状期中第105-125天）单次尾静脉注射该载体，评估其沉默效率、呼吸功能、运动功能、神经病理改变及生存期。相关内容以Intravenous administration of an engineered AAV9-gene-silencing vector suppresses human SOD1 and extends survival in an ALS mouse model发表在Nature Communications！

图片解析

图1. AAV9-amiR-SOD1载体设计及生存期分析：（A）AAV9-amiR-SOD1基因组结构示意图（双amiR由hSMN1启动子驱动）及动物实验方案。（B）第60天给药后Kaplan-Meier生存曲线，AAV组中位生存期较PBS组延长100.5天（n=15 vs n=18）。（C）疾病 onset（体重峰值）分析，AAV组 onset 延迟66天。（D）体重变化曲线显示AAV组体重下降速率较PBS组减缓39%。（E）第90天及第105-125天给药后生存曲线，分别延长生存期29天和15.5天。（F）第90天给药组疾病 onset 延迟18天。（G,H）第90天及第105-125天给药组体重变化曲线，显示治疗后体重下降速率分别减缓20%和30%。

图2. AAV9-amiR-SOD1在中枢和外周组织的广泛持久沉默：（A）第60天给药、第105天检测，CNS和外周组织（脑干、颈胸腰骶脊髓、膈肌、肋间肌、腹肌、舌肌、股四头肌、腓肠肌）中hSOD1 mRNA显著降低。（B）终点（AAV组216-277天，PBS组118-132天）检测，CNS及呼吸肌中hSOD1沉默持续维持，肝脏因肝细胞更新而沉默消失，膀胱和肠道未见沉默。

图3. AAV9-amiR-SOD1改善呼吸功能：（A）全身体积描记法检测第105天（左）和第200天（右）的分钟通气量、呼气峰流量和吸气峰流量。第105天AAV组在所有三个呼吸阶段（基线、CO₂激发、恢复）均与野生型小鼠表现相当，而PBS组在CO₂激发和恢复期显著受损。第200天AAV组虽有所下降，但所有PBS组已死亡。（B）膈肌和舌肌H&E染色，AAV组肌纤维形态正常，PBS组可见萎缩纤维。（C）脑干VRG区神经元计数，AAV组显著多于PBS组。（D）膈肌NMJ免疫荧光染色及定量，AAV组NMJ完整率接近野生型，PBS组严重失神经支配。

图4. AAV9-amiR-SOD1改善运动功能和肌力：（A）第60天给药组的转棒实验和四肢握力测试，AAV组表现显著优于PBS组。（B）第90天给药组，箭头显示治疗后转棒和握力出现“反弹”式改善。（C）第105-125天给药组，红色区域为个体治疗时间窗。（D,E）股四头肌H&E染色（第105天和终点），AAV组肌纤维形态正常，PBS组可见萎缩纤维、中央核和内膜纤维化。（F）腓肠肌NMJ免疫荧光染色及定量，AAV组NMJ完整率接近野生型水平。

图5. AAV9-amiR-SOD1在疾病早期保护运动神经元并减轻神经炎症：（A）第60天给药、第105天检测的腰椎脊髓免疫荧光染色（hSOD1、ChAT、Iba1、GFAP）。（B）定量分析显示AAV组hSOD1在运动神经元中几乎完全沉默，ChAT信号保留，Iba1和GFAP炎症信号显著降低。（C）H&E染色显示PBS组出现空泡、玻璃样轴索球和萎缩神经元，AAV组与野生型相当。（D）α-运动神经元计数，AAV组（44个/切片）与野生型（48个）相当，PBS组仅16个。

图6. AAV9-amiR-SOD1在疾病终点保护运动神经元：（A）终点（PBS组约130天，AAV组约240天）腰椎脊髓免疫荧光染色。（B）定量分析显示AAV组hSOD1持续沉默，ChAT表达保留，Iba1和GFAP炎症信号维持低水平。（C）Nissl染色显示AAV组神经元形态完整。（D）α-运动神经元计数，AAV组（33个/切片）显著多于PBS组（12个），接近野生型水平。

图7. amiR精准加工、转录组正常化及NF-L生物标志物降低：（A）amiR-SOD1向导链丰度远高于过客链，提示精准加工。（B）向导链5'端测序显示无脱靶加工。（C）内源性miRNA谱散点图，AAV处理对整体miRNA表达影响极小。（D）全脊髓转录组差异表达基因分析，PBS组有2057个基因失调，AAV组仅406个。（E）GO分析显示AAV组炎症相关通路富集显著减弱，表达谱趋于野生型。（F）主成分分析证实AAV组转录组向野生型方向回归。（G）血清NF-L水平，AAV组较PBS组降低70%（第105天）至90%（终点），且无ALT/AST肝毒性升高。

结论

本研究开发的AAV9-amiR-SOD1载体通过双miR-33支架设计、人SMN1内源性启动子和AAV9静脉递送的组合策略，实现了对SOD1-ALS小鼠模型中突变hSOD1的高效、持久和全身性沉默。在无症状期单次静脉给药后，CNS和外周关键组织（脑干、脊髓各节段、膈肌、肋间肌、舌肌、四肢肌肉）中hSOD1 mRNA持续沉默，α-运动神经元数量从16个/切片恢复至44个/切片（接近野生型48个），膈肌和腓肠肌NMJ完整率从严重失神经支配恢复至接近野生型水平。呼吸功能（分钟通气量、呼气峰流量、吸气峰流量）在CO₂激发和恢复期均与野生型小鼠表现相当。中位生存期较PBS组延长100.5天，疾病 onset 延迟66天，体重下降速率减缓39%。即使在症状期中（第105-125天）给药，仍延长生存期15.5天。血清NF-L生物标志物降低70-90%，全脊髓转录组从2057个基因失调恢复至仅406个，炎症和免疫相关通路富集显著减弱，内源性miRNA谱未受扰动，ALT/AST无异常升高。该研究首次实现单次静脉注射AAV基因沉默载体在SOD1-ALS模型中的空前疗效，为SOD1-ALS及其他显性毒性获得型基因突变疾病的临床转化提供了强有力的基础。

阅读全文

小提示：本篇资讯仅在梅斯医学APP中开放阅读，请扫描二维码直接下载APP