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背景介绍
嵌合抗原受体T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但在实体瘤治疗中疗效仍不理想。其中，抗原异质性——即肿瘤细胞不完全表达靶向抗原——是限制CAR T细胞治疗实体瘤疗效的主要障碍之一。例如，在靶向EGFR的CAR T细胞治疗胰腺癌的临床试验中，观察到EGFR阴性肿瘤变异体的出现；同样，在接受抗EGFRvIII CAR T细胞治疗的复发性胶质母细胞瘤患者中也记录了抗原异质性现象。因此，迫切需要开发一种能够有效应对抗原异质性的策略，以增强CAR T细胞对实体瘤的抗肿瘤功效。抗原扩散是指内源性T细胞免疫被激活以靶向非靶向肿瘤相关抗原的现象，已有研究表明抗原扩散在增强抗肿瘤疗效中发挥重要作用，但CAR T疗法本身能否诱导具有治疗潜能的抗原扩散仍缺乏充分证据。
研究思路
针对上述挑战，中国人民解放军总医院韩为东教授和王瑶教授团队深入研究了低剂量地西他滨（DAC）预处理的CAR T（dCAR T）细胞在实体瘤模型中的抗肿瘤活性。研究团队首先构建了靶向人CD19的鼠源CAR T细胞，并在培养过程中加入10 nM DAC制备dCAR T细胞。在多种免疫健全小鼠同源肿瘤模型中，dCAR T细胞表现出显著增强的抗肿瘤效应，甚至在没有预淋耗的情况下也能有效清除包含抗原阳性和阴性细胞的混合肿瘤。机制上，dCAR T细胞在与靶抗原结合后持续产生高水平的IFN-γ，诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，并激活常规树突状细胞。这进而刺激了内源性CD8+ T细胞，增强了其识别非靶向肿瘤相关抗原的抗原扩散能力，从而清除远端抗原阴性肿瘤。通过单细胞转录组测序、TCR测序、ATAC-seq、流式质谱等多种技术手段，研究团队系统验证了dCAR T细胞通过表观遗传重编程获得持久的IFN-γ高表达能力，进而触发抗原扩散级联反应。相关内容以Antigen spreading mediates heterogeneous solid tumor eradication by DNA demethylating agent-programmed CAR T cells为题，发表在Science Advances！
图片解析
图1. dCAR T细胞在抗原阳性实体瘤中增强抗肿瘤功效并改变内源性免疫细胞组成： (a) 体内实验设计示意图。(b) 荷CD19⁺B16肿瘤小鼠经NT、CAR T-19和dCAR T-19细胞治疗后肿瘤生长曲线（NT组n=6，其余n=10）。(c) 完全缓解小鼠再次接种CD19⁺B16细胞后的肿瘤重量。(d) 再次接种小鼠脾脏中CAR⁺ T细胞（GFP⁺）百分比的流式图及统计。(e) 质谱流式t-SNE图展示治疗后第7天肿瘤浸润免疫细胞亚群。(f) 肿瘤浸润免疫细胞数量的热图。(g) 肿瘤浸润免疫细胞数量的直方图。(h) 肿瘤浸润内源性T细胞中ICOS与granzyme B、granzyme B与perforin、CD62L与CD44的共表达等高线图。dCAR T细胞治疗显著抑制肿瘤生长，诱导完全缓解，并增加肿瘤内内源性T细胞、NK细胞和DC的浸润。
图2. dCAR T细胞使内源性T细胞能够清除异质性肿瘤： (a) 荷CD19⁺B16和CD19⁻B16F10混合肿瘤小鼠经治疗后肿瘤生长曲线（NT组n=6，其余n=10）。(b) 完全缓解小鼠再次接种CD19⁻B16F10细胞后的肿瘤生长曲线。(c) 再次接种后小鼠脾脏中内源性CD3⁺ T细胞数量比较。(d) CD3抗体阻断实验设计示意图。(e) 存在或不存在抗CD3抗体时肿瘤生长曲线。(f) 小鼠总体生存曲线。dCAR T细胞治疗显著抑制混合肿瘤生长，且该效应依赖内源性T细胞。
图3. dCAR T细胞诱导内源性CD8⁺ T细胞的抗原扩散： (a) 双侧肿瘤模型实验设计（左侧为CD19⁺B16和OVA⁺B16混合肿瘤，右侧为OVA⁺B16远隔肿瘤）。(b) 混合肿瘤和远隔肿瘤的生长曲线。(c,d) 混合肿瘤和远隔肿瘤中内源性OVA四聚体⁺ CD8⁺ T细胞比例的代表性流式图和统计。(e) 脾脏内源性T细胞与CD19和OVA双阴性肿瘤细胞共培养后的IFN-γ ELISPOT结果。(f) 肿瘤浸润内源性CD8⁺ T细胞中TCR克隆扩增分析（大于5个细胞的克隆比例）。dCAR T细胞治疗诱导了针对非靶向抗原的抗原扩散，并产生肿瘤特异性内源性T细胞。
图4. 活化DC是dCAR T诱导抗原扩散的必要条件： (a) 肿瘤浸润DC中特征基因差异表达的点图。(b) mCherry标记的肿瘤抗原被肿瘤内DC摄取的流式分析。(c) Batf3⁻/⁻小鼠实验设计示意图。(d,e) Batf3⁻/⁻小鼠中CD19⁺B16和混合肿瘤的生长曲线。(f,g) Batf3⁻/⁻小鼠脾脏和混合肿瘤中内源性OVA四聚体⁺ CD8⁺ T细胞比例。(h) 抗原阳性和阴性肿瘤细胞中DAMPs相关基因差异表达的点图。(i) 血清和肿瘤中ATP和钙网蛋白水平的ELISA检测。dCAR T治疗诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，且DC对抗原扩散至关重要。
图5. dCAR T细胞通过IFN-γ信号触发抗原阴性肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡： (a) 抗原阴性肿瘤细胞中IFN-γ响应基因表达的点图。(b) GSEA富集图显示抗原阴性肿瘤细胞中抗原加工呈递、细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路和凋亡通路的上调。(c,d) 治疗后第7天血清和肿瘤内IFN-γ水平。(e) 肿瘤浸润CAR⁺ T细胞中Ifng表达评分。(f) 调控Ifng表达的调节子的特异性评分。(g) CAR⁺ T细胞中Tbx21、Atf2、Nfatc1和Stat3的差异表达。(h) CAR⁺ T细胞中Gapdh表达水平。(i) 体外培养的CAR T和dCAR T细胞在Ifng、Tbx21、Gzmb、Prf1、Jak1和Stat1区域的ATAC-seq轨迹。(j) Transwell实验示意图。(k) 存在或不存在抗IFN-γ抗体时抗原阴性肿瘤细胞的膜透化分析。dCAR T细胞通过表观遗传重编程增强IFN-γ产生，进而诱导抗原阴性肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡。
图6. dCAR T细胞增强的IFN-γ产生触发抗原扩散： (a) 体内IFN-γ阻断实验设计示意图。(b,c) 存在抗IFN-γ抗体时混合肿瘤和远隔肿瘤的生长曲线。(d) 混合肿瘤中CD103⁺ DC和内源性OVA四聚体⁺ CD8⁺ T细胞的数量。(e) 远隔肿瘤中内源性OVA四聚体⁺ CD8⁺ T细胞的数量。(f) Ifng⁻/⁻ dCAR T细胞实验设计示意图。(g) 使用Ifng⁻/⁻ dCAR T细胞后混合肿瘤和远隔肿瘤的生长曲线。(h) 机制总结示意图：抗原激活的dCAR T细胞释放高水平IFN-γ，诱导免疫原性细胞死亡，激活DC，进而刺激内源性CD8⁺ T细胞产生抗原扩散，最终清除异质性肿瘤。
结论
本研究首次揭示了低剂量地西他滨编程的dCAR T细胞通过表观遗传重编程获得持久的IFN-γ高表达能力。在与靶抗原结合后，dCAR T细胞释放高水平IFN-γ，诱导抗原阴性的旁观者肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，释放损伤相关分子模式，激活树突状细胞。活化的树突状细胞摄取并交叉呈递非靶向肿瘤抗原，从而启动内源性CD8⁺ T细胞对多种肿瘤相关抗原的识别，实现抗原扩散。在多种免疫健全小鼠肿瘤模型中，dCAR T细胞无需联合其他药物或基因工程改造，即可有效清除包含抗原阳性和阴性细胞的异质性混合肿瘤以及远端抗原阴性肿瘤。该研究提供了一种“一站式”CAR T细胞平台，通过内源性CD8⁺ T细胞的抗原扩散能力，有效根除抗原异质性实体瘤，具有重要的临床转化潜力。
原文链接：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adz4088