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背景介绍
基因编码荧光生物传感器（GEFB）是细胞代谢研究中实时、原位监测代谢物动态变化的重要工具，由生物识别元件和荧光报告元件组成。然而，对于许多关键代谢物（如氨基酸、辅因子等），由于缺乏特异性的生物识别元件，相应的生物传感器仍然匮乏。传统的转录调控因子虽然可作为识别元件，但多数偏好感知胞外代谢物或非生理浓度水平的代谢物。变构酶是生物体中代谢稳态调控的核心元件，其调控域能够特异性结合胞内代谢物并发生构象变化。理论上，变构酶的调控域可作为理想的生物识别元件用于GEFB开发，但这一策略此前尚未被系统验证。
研究思路
针对上述挑战，山东大学高超教授与上海交通大学许平教授团队提出了一种利用变构酶调控域设计基因编码荧光生物传感器的通用方法。该团队首先以大肠杆菌分支酸变位酶PheA的ACT调控域为识别元件，结合环化重排的黄色荧光蛋白（cpSFYFP），构建了特异性检测L-苯丙氨酸的生物传感器Phesor。随后，利用2-乙酰乳酸合酶的调控亚基IlvH和D-柠苹酸合酶的LeuA调控域，分别开发了L-缬氨酸生物传感器Valsor和L-异亮氨酸生物传感器Ilesor。进一步研究发现，多配体结合的调控域可衍生出多种特异性生物传感器：基于PH1780蛋白的四个胱硫醚β-合酶（CBS）结构域，团队开发了两个检测范围互补的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）生物传感器（SAMsor和SAMsorL）以及一个S-甲基-5'-硫代腺苷（MTA）生物传感器。这些生物传感器在活细胞、发酵过程监测和临床体液样本中均实现了对目标代谢物的实时、原位、高时空分辨检测。相关内容以“A versatile method for designing biosensors via regulatory domains of allosteric enzymes”为题，发表在Nature Communications。
图片解析
图1. 利用PheA的ACT结构域作为L-苯丙氨酸生物传感器的识别元件： (a) 变构酶的调控机制及基于变构调控域和cpSFYFP开发GEFB的工作流程示意图。(b) ACT二聚体结构示意图（基于PDB:1PSD）。(c) PheA的结构域组成与功能示意图。(d-g) 四种PheA截短体与cpSFYFP融合后对分支酸、预苯酸、苯丙酮酸和L-苯丙氨酸的响应。(h) PheAACT-cpSFYFP对L-苯丙氨酸的剂量响应曲线。(i) PheAACT-cpSFYFP的特异性分析（其他19种氨基酸及类似物无响应）。(j) PheA与L-苯丙氨酸的分子对接分析，显示两个L-苯丙氨酸分子结合于ACT二聚体界面。(k) L-苯丙氨酸结合位点突变对响应的消除作用。
图2. L-苯丙氨酸生物传感器Phesor的优化与应用： (a) Phesor-0.38对L-苯丙氨酸的剂量响应曲线。(b) 通过接头随机突变和高通量筛选优化Phesor-0.38，共筛选672个突变体。(c) Phesor对L-苯丙氨酸的剂量响应曲线（ΔRmax=4030±40%，Kd=1760±40 μM）。(d) Phesor的可逆性分析。(e) 透化大肠杆菌中表达Phesor对外源梯度浓度L-苯丙氨酸的实时响应。(f) 利用Phesor检测野生型与工程菌株中胞内L-苯丙氨酸水平差异。(g) 透化HEK293FT细胞中Phesor对L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸的响应成像及定量。(h) Phesor在细胞中对梯度L-苯丙氨酸的响应。(i) Phesor验证LAT1在L-苯丙氨酸摄取中的功能。(j) 利用Phesor检测人血清、尿液和干血斑中L-苯丙氨酸的工作流程。(k-l) Phesor与HPLC测定血清(k)和尿液(l)中L-苯丙氨酸的Bland-Altman一致性分析。(m) Phesor检测健康儿童与苯丙酮尿症患儿干血斑中L-苯丙氨酸水平。
图3. 基于2-乙酰乳酸合酶调控亚基IlvH的L-缬氨酸生物传感器Valsor的开发与应用： (a) 2-乙酰乳酸合酶（IlvIH）的结构与功能示意图。(b) Valsor-0.03对L-缬氨酸的剂量响应曲线。(c) 接头随机突变优化Valsor-0.03（173个突变体）。(d) Valsor对L-缬氨酸的剂量响应曲线（ΔRmax=875±52%，Kd=2170±110 μM）。(e) 透化大肠杆菌中Valsor对外源L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的实时响应。(f) Valsor验证LivJ和LivK在L-缬氨酸摄取中的功能。(g) 透化HEK293FT细胞中Valsor对L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的响应成像及定量。(h) Valsor在细胞中对梯度L-缬氨酸的响应。(i) Valsor检测不同BCAT抑制剂对胞内L-缬氨酸水平的影响。(j-k) Valsor与HPLC测定发酵培养基中L-缬氨酸的相关性分析(j)和一致性分析(k)。(l) 干扰物对Valsor定量结果无影响。
图4. 基于D-柠苹酸合酶LeuA调控域的L-异亮氨酸生物传感器Ilesor的开发与应用： (a) CimA的结构与功能示意图。(b) Ilesor-0.23对L-异亮氨酸的剂量响应曲线（ΔRmax=97.0±2.4%，Kd=1700±660 μM）。(c) 接头随机突变优化Ilesor-0.23（375个突变体）。(d) Ilesor对L-异亮氨酸的剂量响应曲线（ΔRmax=1325.3±7.1%，Kd=3620±400 μM）。(e) 透化大肠杆菌中Ilesor对外源L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸的实时响应。(f) Ilesor验证LivJ（而非LivK）在L-异亮氨酸摄取中的功能。(g) 透化HEK293FT细胞中Ilesor对L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸的响应成像及定量。(h) Ilesor在细胞中对梯度L-异亮氨酸的响应。(i) Ilesor检测不同BCAT抑制剂及IDH1^R132H突变对胞内L-异亮氨酸水平的影响。(j-k) Ilesor与HPLC测定发酵培养基中L-异亮氨酸的相关性分析(j)和一致性分析(k)。(l) 干扰物对Ilesor定量结果无影响。
图5. 利用PH1780作为识别元件衍生SAM和MTA生物传感器： (a) PH1780的结构示意图（四个CBS结构域形成两个Bateman模块，四个潜在配体结合位点）。(b-c) 将cpSFYFP插入PH1780四个CBS结构域中间构建的初始变体对不同腺苷衍生物和金属离子的响应(b)及对梯度SAM和MTA的响应(c)。(d) 90个不同插入位点变体对100 μM SAM或MTA的响应热图，Log2(响应比)指示特异性。(e) SAMsor-0.85对梯度SAM或MTA的响应。(f) SAMsor-0.85的特异性分析（仅SAM响应）。(g) MTAsor-0.64对梯度SAM或MTA的响应。(h) MTAsor-0.64的特异性分析（仅MTA响应）。(i) SAMsor-0.85中SAM或MTA结合位点突变对SAM响应的影响。(j) MTAsor-0.64中SAM或MTA结合位点突变对MTA响应的影响。
图6. SAM生物传感器SAMsor的优化与应用： (a) SAM的生物学功能示意图。(b) SAMsor-0.85接头随机突变优化（279个突变体）。(c) SAMsor对SAM的剂量响应曲线（ΔRmax=157.4±1.8%，Kd=2.6±0.1 μM，LOD=310 nM）。(d) SAMsor的特异性分析（对MTA、SAH、腺苷、L-甲硫氨酸等无响应）。(e) 透化大肠杆菌中SAMsor对外源梯度浓度SAM的实时响应。(f) SAMsor检测MetK、RLSS、MetJ、T3SH等酶在SAM代谢中的功能。(g-h) 透化HEK293FT细胞中SAMsor对顺序添加SAH、MTA、L-甲硫氨酸、腺苷和SAM的响应成像(g)及定量(h)。(i) SAMsor在细胞中对梯度SAM的响应。(j) SAMsor检测不同MATase激活剂或抑制剂对胞内SAM水平的影响。
图7. 低检测范围SAM生物传感器SAMsorL的优化与应用： (a) 利用SAMsorL检测人血清和尿液中SAM的工作流程示意图。(b) SAMsor-0.34对SAM的剂量响应曲线（ΔRmax=80.0±4.4%，Kd=900±110 nM）。(c) SAMsor-0.34接头随机突变优化（2,715个突变体）。(d) SAMsorL对SAM的剂量响应曲线（ΔRmax=128.5±1.1%，Kd=379±41 nM，LOD=57.25 nM）。(e-f) SAMsorL与HPLC测定血清(e)和尿液(f)中SAM的相关性分析（健康人与肺癌患者）。(g-h) 血清(g)和尿液(h)中SAM测定的Bland-Altman一致性分析。(i-j) 健康人与肺癌患者血清(i)和尿液(j)中SAM水平差异（肺癌患者血清SAM升高约2.81倍）。(k-l) 基于血清(k)和尿液(l)SAM水平的ROC曲线（血清AUC=0.759，尿液AUC=0.585）。
结论
本研究建立了一种利用变构酶调控域作为生物识别元件开发基因编码荧光生物传感器的通用方法。通过选取PheA的ACT结构域、IlvH调控亚基、CimA的LA结构域以及PH1780的CBS结构域，结合环化重排荧光蛋白，成功构建了针对L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、S-腺苷甲硫氨酸和S-甲基-5'-硫代腺苷的高特异性、高灵敏度生物传感器。这些传感器在活细胞中实现了对目标代谢物的实时、原位、亚细胞分辨率动态监测，在发酵过程在线监控中与HPLC结果高度一致，并在临床体液样本（血清、尿液、干血斑）检测中展现出便捷、快速、低成本的优势。特别是Phesor成功区分了苯丙酮尿症患儿与健康儿童，SAMsorL在肺癌患者血清中检测到SAM水平显著升高。该策略为开发其他代谢物生物传感器提供了通用框架，有望推动代谢研究、生物制造和临床诊断领域的发展。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-026-73277-9