深度解析医学证据，DeepEvidence为你支撑决策
癌症最可怕的地方，往往不是原发灶，而是悄无声息的转移。尤其是肺转移，很多患者在早期几乎没有明显症状，等到影像学发现时，病情往往已经进入中晚期。过去十多年，科学家一直试图利用肿瘤微环境中的“蛋白酶异常活性”来设计智能探针，让探针只在肿瘤附近被激活，从而实现精准诊断和治疗。然而，一个关键难题始终没有解决：不同肿瘤组织里的蛋白酶极其复杂，传统方法往往只能研究单个纯化蛋白酶，无法真正还原真实肿瘤环境中的“集体作战”状态。
今日，美国丹娜-法伯癌症研究院Zhou Xin教授和波士顿大学Liangliang Hao教授提出了一种名为PSurf的全新平台。简单来说，这是一套能够直接在真实肿瘤组织样本中“筛选蛋白酶活性”的系统。研究人员不仅找到了肿瘤特异性切割序列，还进一步将其开发成可在体内激活的智能生物传感器，最终实现了：只需分析尿液，就能区分正常小鼠和肺转移小鼠。更重要的是，这套系统未来还有望用于肿瘤成像、精准给药乃至条件激活药物开发。想关成果以“Proteolysis activity mapping and substrate discovery platform for identifying tumor-activated biosensors”为题发表在《Nature Chemical Biology》上。
研究的第一步，是搭建一个足够“庞大”的蛋白酶底物库。团队利用酵母表面展示技术，在酵母细胞表面随机展示超过上亿种不同的七肽序列（图1a）。每条短肽两端都连接了不同荧光标签，一旦被蛋白酶切开，其中一个标签就会脱落，从而通过流式细胞术快速识别哪些序列被切割（图1b）。换句话说，研究人员等于给每个酵母都装上了一个“蛋白酶报警器”。为了验证系统是否可靠，研究人员首先选用了经典的TEV蛋白酶进行测试。他们发现，系统能够准确区分“标准底物”和“非标准底物”，而且还能识别不同TEV突变体的切割偏好差异（图1c-1e）。这意味着PSurf不仅能判断“会不会切”，还能识别“切得有多偏爱”。随后，团队进一步构建了随机七肽文库，覆盖超过3×108种序列空间（图1f）。相比传统人工合成肽库，这种策略的覆盖范围提高了100到10000倍。
图1：研究团队构建了PSurf酵母展示平台，通过随机七肽文库和双荧光标签，实现对蛋白酶切割事件的大规模筛选
接下来，研究团队把目光瞄准了肿瘤领域非常重要的一类蛋白酶——Cathepsin B（CTSB）。这种蛋白酶与多种实体瘤进展密切相关，也是抗体偶联药物（ADC）中常用的“切割开关”。研究人员在不同pH条件下筛选CTSB偏爱的底物序列（图2a）。结果发现，在酸性较强的pH 4.4环境下，LVG序列被明显富集；而在更接近肿瘤微环境的pH 6.4和7.4条件下，则出现了RR和VR等新型偏好序列（图2b-2d）。这说明，同一种蛋白酶在不同环境下，切割偏好其实会发生明显变化。更有意思的是，团队还从中筛选出了一个此前未被报道的新底物RRLYAFL。研究人员将它做成荧光探针后发现，它在肿瘤酸性环境中的切割效率，甚至超过了传统CTSB探针（图2f）。这意味着PSurf不仅能找到“已知规则”，还能发现传统方法漏掉的新型高性能序列。
图2：PSurf成功识别出Cathepsin B在不同pH环境下的切割偏好，并发现了性能优于传统探针的新型底物序列。
如果说前面的实验还停留在“单一蛋白酶”层面，那么真正体现PSurf威力的，是它直接进入了真实肿瘤组织。研究人员构建了两种肺转移小鼠模型：一种是结直肠癌肺转移，另一种是黑色素瘤肺转移。随后，他们从肺、肝、脾、肾等正常组织以及肿瘤肺组织中提取细胞外基质液（图3a）。这些样本里混杂着真实组织环境中的各种蛋白酶、抑制剂和调控因子，比纯化蛋白酶复杂得多。初步筛选后，研究人员发现，无论健康组织还是肿瘤组织，都倾向于切割富含苯丙氨酸（F）和亮氨酸（L）的序列（图3b、3c）。这意味着很多蛋白酶活性其实是“共享”的，仅靠普通筛选很难找到真正肿瘤特异性的底物。于是，团队设计了一套“差异筛选”流程：先用健康组织逐步淘汰那些容易被正常组织切割的序列，再用肿瘤组织重新富集真正肿瘤敏感的底物（图3d）。经过多轮筛选后，原本大量的L/F富集序列明显减少，取而代之的是更加多样化的肿瘤特异性序列（图3e）。
图3：研究人员利用肺转移肿瘤和健康组织进行差异筛选，逐步去除正常组织共享底物，富集肿瘤特异性序列
随后，研究团队挑选出多个候选序列进行深入验证，并将它们制作成荧光探针。结果发现，这些PSurf筛选得到的新探针，在肿瘤组织中的切割速度明显高于健康肺组织，而在炎症肺组织中的活性却非常低（图4a-4c）。相比传统MMP底物探针，新探针表现出了更好的肿瘤特异性。更重要的是，这些底物并不是只被某一种蛋白酶切割。研究人员利用不同蛋白酶抑制剂进行分析后发现，肿瘤组织中的切割行为实际上来自多种丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶共同作用（图4d）。这也解释了为什么传统“单蛋白酶开发策略”往往效果有限——真实肿瘤环境根本不是“一把剪刀”，而是一整个复杂的“剪刀军团”。
图4：筛选得到的新底物在肿瘤组织中表现出更高切割活性，同时揭示肿瘤蛋白酶网络具有多酶协同特征
在确认DNLGRAF具有优异性能后，团队进一步把它开发成了“空间成像探针”。他们设计了一种特殊结构：探针平时处于“关闭”状态，一旦在肿瘤区域被蛋白酶切开，就会暴露出能够插入细胞膜的结构，从而把荧光信号“锁定”在肿瘤附近（图5a）。在肺转移小鼠体内测试时，研究人员发现，这种探针会明显富集在肿瘤肺部，而健康肺组织信号很低（图5b、5c）。而且，荧光强度与肿瘤负荷呈明显正相关（图5d）。进一步在组织切片中观察后，研究人员发现，探针激活区域与病理染色标记出的转移结节高度重合（图5e）。换句话说，这种探针几乎像是在“点亮”肿瘤边界。
图5：基于DNLGRAF开发的空间成像探针，可在体内精准点亮肺转移结节，实现肿瘤定位成像。
不过，真正让这项研究走向“未来临床想象”的，是最后的尿液检测系统。研究团队将四种PSurf筛选得到的底物，与靶向肿瘤的纳米抗体和DNA条形码结合，构建成一种“智能纳米传感器”（图6a）。这些传感器进入体内后，会优先聚集到肿瘤区域；如果附近存在特定蛋白酶活性，底物就会被切开，释放出DNA条形码（图6b）。这些DNA随后进入血液循环，再经过肾脏过滤进入尿液。最终，研究人员只需要检测尿液中的DNA信号，就能判断体内是否存在肿瘤。为了放大检测灵敏度，团队还引入了CRISPR-Cas12a系统。Cas12a在识别到对应DNA条形码后，会触发级联荧光反应，相当于给尿液检测又加了一层“分子扩音器”。实验结果显示，四种传感器都能显著区分健康小鼠和肺转移小鼠（图6d）。ROC分析中，单个传感器的AUC达到0.82-0.89，而四个传感器联合后，AUC进一步提升至0.93（图6e）。这个结果意味着，仅靠尿液分析，就已经能够实现非常高精度的肺转移识别。
图6：研究团队构建了可通过尿液读取信号的智能纳米传感器，并结合CRISPR-Cas12a实现高精度肿瘤检测。
小结
研究团队认为，PSurf最大的意义，不只是找到几个新底物，而是建立了一种全新的“组织级蛋白酶活性筛选范式”。过去，人们往往先根据转录组数据猜测哪种蛋白酶重要，再单独验证；而PSurf则直接从真实组织环境出发，让组织本身“告诉你”哪些序列最敏感、最特异。未来，这套系统不仅可以用于肿瘤检测，还可能扩展到炎症、衰老、纤维化等多种疾病场景。更重要的是，它为“条件激活药物”提供了新的设计思路：药物平时保持沉默，只有进入特定病灶后才被蛋白酶激活，从而最大程度降低副作用。或许在不久的将来，我们真的能够实现：打一针探针、留一份尿液，就能提前发现那些隐藏在身体里的微小转移灶。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41589-026-02218-w