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CRISPR作为精准基因组编辑工具，已广泛应用于发育、癌症及免疫等领域的功能基因组学研究，能揭示基因表达调控及肿瘤发生、发展、转移的机制。近年来，单细胞多组学与混合型单细胞CRISPR筛选技术的结合，可实现单细胞分辨率下的基因型-表型图谱绘制，加深了对复杂细胞系统的理解，但现有方法缺乏空间背景信息，无法还原组织原位基因调控规律。空间CRISPR基因组学技术应运而生，其弥补了空间信息的缺失、提高了分辨率和通量，但仍受限于靶向panel、解离过程中空间信息的丢失或RNA覆盖不全等。目前亟需一个能统一空间映射与无偏总RNA分析、同时保留天然组织结构并直接关联扰动与分子机制的平台。

近日，耶鲁大学樊荣团队及合作者提出了Perturb-DBiT技术，这是一种空间分辨、无偏倚、混合型体内CRISPR筛选方法，能够在同一组织切片上原位共检测空间全转录组总RNA与单向导RNA（sgRNA），同步解析扰动信息、转录状态、RNA调控与细胞空间互作。在人类癌症转移定植模型中，研究团队使用包含8万余条sgRNA的大规模文库开展筛选，并同步分析其对应的全转录组RNA；该技术完整捕捉了基因扰动引发的长链非编码RNA（lncRNA）共变异、microRNA-mRNA相互作用以及不同氨基酸特异性tRNA改变，证实其与肿瘤迁移和增殖相关。结合转录拟时序轨迹分析，研究进一步解析了基因扰动对肿瘤克隆演化与克隆间协同作用的影响。在免疫健全的同源小鼠模型中，该技术直观检测了不同基因扰动会对肿瘤免疫浸润、免疫抑制产生差异化、协同性调控效应。总之，Perturb-DBiT为复杂组织中的扰动响应提供了空间分辨的全景视图，可在保留组织原生结构的前提下，揭示基因扰动引发的分子与表型变化。

文章发表在Nature Biotechnology

Perturb-DBiT采用poly(A)捕获（PAC）和直接捕获（DC）两种互补策略，可在同一组织切片上原位共分析sgRNA和空间转录组，兼容新鲜冷冻组织、FFPE石蜡包埋组织。PAC策略为所有RNA（含 sgRNA）原位添加poly(A)尾，再借助带有唯一分子标识符（UMI）的 poly (dT) 引物完成捕获；DC策略则利用骨架序列互补引物直接捕获sgRNA，同时使用poly (dT) 完成mRNA捕获。

研究团队在多种体内CRISPR动物模型、两类组织样本中对Perturb-DBiT进行性能评估，筛选文库覆盖仅2条sgRNA的小型文库到超8万条的全基因组文库。结果显示，Perturb-DBiT一致地生成了高质量空间转录组数据，PAC的mRNA捕获能力优于DC，单个空间位点最高可检测到7,903个基因与21,821个UMI；在不同实验条件及肿瘤和免疫环境中，两种策略均能高效精准地捕获sgRNA。在中小型文库中，Perturb-DBiT展现了优异的sgRNA回收率、空间特异性和可重现性，靶向同一基因的sgRNA检测结果一致性高。

研究团队还将Perturb-DBiT应用于已发表的CRISPR肝癌基因工程小鼠模型的FFPE样本。该技术重建了肿瘤Perturb-DBiT组织结构与上皮来源，揭示了干细胞特征；与传统MIPS测序对比，在单个目标区域（ROI）内检测到的sgRNA数量提升约三倍，目标基因检出率达95%，AUC为0.724，检测灵敏度与准确性显著提升，且生物学重复间一致性良好。借助pUMAP整合扰动与转录组数据，可划分不同扰动对应的细胞状态，并成功解析了Cdkn2a、Bap1等抑癌基因缺失介导的致癌通路变化。

图1. Perturb-DBiT概述

研究团队验证了Perturb-DBiT在基因组规模文库中的适用性，使用包含77,441条sgRNA的人CRISPR 敲除混合文库（Brunello），在结直肠癌肺转移小鼠模型中开展体内筛选。结果显示，该技术在单张组织切片检测到235个独特sgRNA和5,740个sgRNA UMI，并在多张连续切片中稳定捕获sgATG4A、sgMT1E、sgS100A4等驱动肿瘤定植的关键扰动靶点。通过计算扰动评分量化肿瘤克隆空间结构，发现六个高富集sgRNA在肿瘤集落内呈空间聚集，且存在sgRNA对共定位现象，揭示转移病灶内存在潜在克隆协同作用。进一步借助iStar计算框架融合空间组学数据与病理图像，生成近单细胞分辨率的扰动空间图谱，确认sgS100A4、sgSEMA6B和sgMT1E为最富集的扰动，提示其在转移性肿瘤适应中的重要作用。

图2.Perturb-DBiT定位通过与组织学整合揭示高分辨率肿瘤定植筛查

接下来，研究团队评估了Perturb-DBiT在上述肺组织切片上的总RNA捕获效率。通过结合外显子和内含子基因数据，每个位点平均检出7,903个基因和21,821个UMI；该技术不仅能全面捕获编码RNA外，还能无偏检测miRNA、lncRNA等各类非编码RNA，约56%的reads可比对至蛋白编码RNA，这些非编码RNA在肿瘤区域呈现全局富集。特别地，顶级富集sgRNA与特定lncRNA表达程序共变异，提示扰动可能作为lncRNA调控网络的关键节点；部分内含子lncRNA（如BET1-AS1、EP300-AS1）与其宿主基因表达高度耦合，提示转录协同调控。此外，借助大规格高分辨率微流控芯片，Perturb-DBiT可精确绘制精细结构特征，揭示多个调控肺癌转移相关编码基因与非编码RNA；结合iStar框架可生成近单细胞分辨率空间转录和扰动图谱，发现sgATG4A、sgUBE2U为两大高频扰动靶点。

交叉平台验证显示，Perturb-DBiT不受靶向探针限制，转录组与克隆图谱覆盖范围更全面。该技术还首次系统解析了基因扰动对tRNA和miRNA的空间变化影响，不同基因扰动会引发特异性tRNA亚群的协同下调，这类tRNA变化模式在空间上呈现局灶性分布，暗示局部翻译应激或RNA加工异常。各类扰动可改变miRNA表达，如敲除MT1E会上调促癌miR-21，二者空间分布完全重合，细胞迁移增殖能力显著提升。各抑癌基因敲除则能重塑ceRNA网络，诱导特异性lncRNA-miRNA-mRNA复杂互作。拟时序分析显示，sgRNA扰动分布与肿瘤细胞分化轨迹重合，证明该技术可在原位重现肿瘤分化过程。

图3. 肺转移定殖模型中小型非编码RNA的空间定位

研究团队在免疫健全小鼠同源肿瘤模型中，利用全基因组CRISPR 敲除文库（78,637个sgRNA）探究了基因扰动对肿瘤微环境的影响。结果显示，共检出91个sgRNA，17,548个sgRNA UMI；空间转录组可解析出与组织形态学一致的细胞类型特异性聚类，如淋巴结、气道上皮以及两个转录和空间特征各异的肿瘤聚类。两个相邻肿瘤聚类呈现完全不同的分子特征与扰动模式，聚类1富集sgZc3h12a，以CD8⁺T细胞浸润为主，PD-L1低表达，呈现促炎微环境；聚类2则富集sgNeu4和sgPax8，高表达PD-L1及肿瘤相关巨噬细胞标志物，呈现免疫抑制微环境。配体-受体分析揭示，聚类2中ECM组织、黏附和血管生成通路显著增强。这表明Perturb-DBiT可有效解析基因扰动、肿瘤空间异质性与免疫微环境之间的关联。

图4. Perturb-DBiT突出显示调控TME结构特征的基因

Perturb-DBiT突破了现有空间CRISPR筛选局限，首次在组织原位实现了基因组规模扰动与全转录组的空间共分析，能兼容FFPE与新鲜组织，通用性极强。该技术不仅能够识别驱动肿瘤进展和转移的关键基因，还可揭示扰动诱导的非编码RNA调控网络和代谢重塑特征，为理解肿瘤异质性、克隆演化和免疫微环境互作提供了全新视角。

参考文献：

https://www.nature.com/articles/s41587-026-03127

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