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2026年5月14日，广州医科大学附属第一医院、呼吸疾病全国重点实验室王健/杨凯教授团队在Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology(ATVB)发表题为“An Integrated Single-Cell Atlas Reveals Cross-Subtype Heterogeneity in Human Pulmonary Hypertension”的原创研究论文。该研究整合多项公开人类肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)单细胞转录组数据，构建了跨临床亚型的人类PH单细胞图谱，并进一步开发了基于多任务学习框架的分层注释工具PH-Map。该研究为PH单细胞数据的标准化注释、跨亚型比较以及候选细胞状态和通路的优先级筛选提供了统一参考框架。实验室王健教授和杨凯教授为论文共同通讯作者，2023级在读博士研究生冯华焯、2024级在读硕士研究生赖家璇为论文共同第一作者。
【研究背景】
肺动脉高压是一类以肺血管阻力升高和肺血管重构为主要特征的严重心肺血管疾病。其病理改变涉及肺血管内皮细胞功能障碍、平滑肌细胞增殖和表型转换、外膜纤维化以及血管周围炎症细胞浸润等多个过程。不同PH临床亚型具有不同的上游驱动因素，包括原发性肺小动脉病变、慢性血栓栓塞、肺实质疾病相关低氧以及多因素机制等，因此可能对应不同的血管、基质和免疫重塑模式。
近年来，单细胞RNA测序技术为解析PH细胞异质性和疾病相关细胞状态提供了重要工具。已有研究报道了PH相关平滑肌细胞亚群、毛细血管内皮免疫激活、成纤维细胞补体激活以及免疫细胞功能改变等现象。然而，现有PH单细胞研究仍存在明显碎片化特征：不同研究覆盖的临床亚型有限，样本数量相对不足，组织来源和分析流程不完全一致，细胞命名和注释体系也缺乏统一标准。这些因素限制了不同研究之间的直接比较，也影响了对人类PH共同和亚型特异细胞程序的系统理解。
此外，PH研究长期依赖动物模型和体外培养细胞系统。尽管这些系统对机制研究具有重要价值，但其与人类PH肺组织中真实细胞状态之间的对应关系仍需在统一的人类疾病参考框架下重新评估。因此，建立一个跨亚型、可复用、具有分层注释体系的人类PH单细胞图谱，对于整合既往研究、标准化后续数据分析以及识别更具可转化价值的细胞状态具有重要意义。
基于上述问题，本研究通过统一的数据重定量、质量控制、批次校正和层级注释流程，整合公开可获得的人类PH单细胞转录组数据，构建了跨亚型人类PH单细胞图谱，并在此基础上开发了PH-Map分层细胞注释工具。
【研究结果】
1. 构建跨亚型人类PH单细胞图谱
研究团队整合了来自8项研究的公开单细胞RNA测序数据。其中，6项研究的64个人类样本用于构建核心图谱，覆盖特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary arterial hypertension, IPAH)、系统性硬化相关肺动脉高压(systemic sclerosis-associated PAH, SSc-PAH)、慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronic thromboembolic pulmonary hypertension, CTEPH)以及健康对照。另有2项研究的样本作为外部验证数据集。
为降低不同研究之间由于上游处理流程差异带来的技术偏倚，研究团队优先采用统一的STARsolo流程对可获得原始数据的数据集进行重定量，并结合统一的质量控制、批次校正和注释策略进行整合分析。最终，核心图谱保留了235,621个高质量细胞。
在注释策略上，研究团队采用分层细胞注释流程，首先定义主要细胞谱系，再对各主要细胞群进行逐层细分。最终图谱包含6大细胞谱系和58个精细细胞状态，形成了适用于PH单细胞研究的层级化细胞参考框架。
图1. 跨亚型人类PH单细胞图谱的构建流程与分层注释框架
2. 内皮细胞状态在PH、人类疾病、动物模型和体外培养系统中存在差异
内皮细胞是PH肺血管重构的重要参与者。研究团队整合分析了肺组织来源内皮细胞以及原代培养内皮细胞，共识别出9类肺内皮细胞亚群，包括淋巴管内皮细胞和多类血管内皮细胞状态。
在跨亚型比较中，研究发现CXCL12+内皮细胞在多个PH亚型中表现出相对一致的富集和转录扰动，其相关通路涉及细胞外渗、钙离子摄取和肌动蛋白丝组织等过程。这提示CXCL12+内皮细胞可能代表人类PH中较为稳定的血管重构相关细胞状态。
研究还重新评估了既往动物模型中报道的毛细血管内皮MHC-II相关信号。结果显示，MHC-II相关基因在慢性低氧诱导PH小鼠模型和MCT诱导PH大鼠模型中较为明显，但在SuHx-PH模型以及整合后的人类PH数据中未稳定复现。这一结果提示，部分前临床模型中的内皮细胞信号可能具有模型依赖性，在向人类疾病外推时需要谨慎解释。
此外，研究团队比较了原代培养内皮细胞与新鲜分离肺组织内皮细胞的转录差异。结果显示，培养后的内皮细胞会逐渐丢失部分原位组织特征，并出现趋同的转录改变，包括细胞外基质合成、增殖和迁移相关程序增强，而部分炎症相关程序受到抑制。这说明体外培养细胞系统不能完全替代原位组织微环境下的内皮状态。
图2. PH相关内皮细胞状态及其在动物模型和体外培养系统中的差异
3. 重新解析平滑肌细胞去分化状态，并限定成纤维细胞补体激活的细胞来源
基质细胞是肺血管结构维持和病理重构的重要细胞群。本研究在整合图谱中识别出13类基质细胞亚群，包括成纤维细胞、平滑肌细胞和周细胞。与既往研究一致，研究团队观察到收缩型CNN1+平滑肌细胞在IPAH和SSc-PAH中明显减少，提示平滑肌细胞收缩表型丢失是PH血管重构中的重要特征。
既往研究曾提出肺动脉平滑肌细胞可分为收缩型、合成型、氧感应型和成纤维样状态。然而，在更大规模、跨亚型的整合数据中，部分既往定义的状态在标志基因和通路层面存在明显重叠。基于本研究的统一图谱，研究团队进一步划分了4类去分化平滑肌细胞状态，并发现COX4I2+平滑肌细胞并不应简单理解为单一“氧感应”状态，其转录程序更明显涉及免疫调节、应激反应和代谢相关过程。不同PH亚型中，COX4I2+平滑肌细胞的通路改变也呈现明显差异，提示平滑肌细胞重塑具有亚型依赖性。
在成纤维细胞方面，既往研究提示补体系统，尤其是C3上调，可能参与PH病理过程。本研究进一步将这一现象定位到更精细的细胞亚群层面。结果显示，C3表达并非在所有成纤维细胞中普遍升高，而主要集中于两个外膜成纤维细胞亚群，并且在IPAH中更为突出，而在SSc-PAH和CTEPH中未观察到相同程度的上调。这一结果将“成纤维细胞补体激活”进一步限定到特定细胞背景和临床亚型中。
图3. PH中平滑肌细胞去分化状态及外膜成纤维细胞补体激活特征
4. 细胞毒性淋巴细胞在多个PH亚型中出现共同改变
免疫细胞，尤其是淋巴细胞和NK细胞，在PH血管周围炎症和免疫微环境重塑中具有重要作用。本研究在整合图谱中识别出12类淋巴细胞亚群，包括B细胞、T细胞和NK细胞。
跨亚型比较显示，GZMH+ CD8+ T细胞和CD16+ NK细胞在多个PH亚型中均表现出减少和显著转录改变，提示细胞毒性淋巴细胞区室可能存在较为一致的重塑趋势。进一步分析显示，不同PH亚型中的细胞毒性、炎症反应和应激反应程序并不完全一致。在IPAH和CTEPH中，CD8+ T细胞和NK细胞的细胞毒性相关评分降低；而在SSc-PAH中，GZMH+ CD8+ T细胞的细胞毒性相对保留，但CD16+ NK细胞仍显示细胞毒性下降。炎症反应方面，IPAH和SSc-PAH中GZMH+ CD8+ T细胞炎症评分升高，而CTEPH中相关炎症评分降低。应激反应则主要在CD16+ NK细胞中增强。这些结果提示，不同PH亚型中的淋巴细胞功能重塑既存在共同趋势，也具有明确的亚型特异性。
图4. PH临床亚型中的细胞毒性淋巴细胞重塑
5. 巨噬细胞相关炎症程序呈现明显亚型异质性
髓系细胞，尤其是巨噬细胞，是PH重构肺血管微环境中的重要炎症细胞群。本研究识别出15类髓系细胞亚群，包括树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞和中性粒细胞。
与淋巴细胞中观察到的部分共同趋势不同，巨噬细胞相关变化表现出更明显的临床亚型异质性。研究发现，不同PH亚型中巨噬细胞的细胞丰度变化与转录扰动并不总是一致。例如，在IPAH中，APOE+和MKI67+巨噬细胞显示明显转录扰动，但丰度变化并不显著；在SSc-PAH中，SCGB3A1+和MKI67+巨噬细胞明显扩增；在CTEPH中，F13A1+巨噬细胞和肥大细胞虽然未表现出显著数量扩增，但出现明显转录重塑。
进一步的功能分析显示，IPAH、SSc-PAH和CTEPH中巨噬细胞炎症和细胞因子相关程序具有不同偏向。IPAH中APOE+和MKI67+巨噬细胞更富集急性炎症相关程序；SSc-PAH中巨噬细胞呈现更明显的纤维化相关特征；CTEPH中APOE+和F13A1+巨噬细胞则表现出调节和清道夫相关程序增强。这些结果说明，PH中髓系免疫重塑不能简单概括为单一的“巨噬细胞激活状态”，而应结合具体临床亚型进行解释。
图5. 不同PH亚型中髓系细胞和巨噬细胞功能程序的异质性
6. 开发PH-Map，实现PH单细胞数据的快速分层注释
细胞类型命名不一致和缺乏分层注释，是当前PH单细胞研究整合和比较中的重要障碍。为解决这一问题，研究团队基于整合后的PH单细胞图谱开发了PH-Map。
PH-Map采用多任务学习框架，可在一次模型训练和预测过程中同时输出多个层级的细胞注释结果。与需要分别训练不同层级模型的方法相比，PH-Map更适合PH单细胞数据中“粗粒度谱系—中间亚群—精细细胞状态”的层级化注释需求。
研究团队将PH-Map与CellTypist、scANVI等常用方法进行了比较。结果显示，PH-Map在训练和预测速度方面具有较好效率，同时在不同细胞数量条件下保持稳定的预测性能。在精细层级注释中，PH-Map仍能维持较高准确率。进一步在外部PH数据集中验证时，PH-Map生成的细胞注释结果与典型标志基因表达模式相一致，并表现出较好的层级标签一致性。因此，PH-Map不仅是本研究图谱的配套分析工具，也可作为未来PH单细胞研究进入统一参考体系的标准化入口。
图6. PH-Map的模型框架、性能评估及外部队列验证
【研究结论】
本研究构建了一个跨亚型的人类PH单细胞图谱，系统整合了IPAH、SSc-PAH、CTEPH和健康对照数据，并在统一的分层注释框架下解析了血管、基质和免疫细胞在不同PH亚型中的共同与特异性变化。
研究结果表明，PH中存在若干跨亚型反复出现的细胞状态改变，例如CXCL12+内皮细胞富集、收缩型CNN1+平滑肌细胞减少以及细胞毒性淋巴细胞状态减弱。同时，部分细胞群表现出明显亚型依赖性，尤其是巨噬细胞相关炎症和细胞因子程序，并不收敛于单一的共同PH状态。
该研究还提示，动物模型和体外培养系统中的部分细胞信号并不能简单外推至人类PH。通过跨系统比较，研究团队发现某些内皮细胞相关信号在特定动物模型中较为突出，但在人类PH整合数据中并未稳定复现；原代培养内皮细胞也会逐渐偏离原位肺组织内皮状态。这些发现为理解模型系统和人类疾病之间的差异提供了新的参考。
总体而言，该研究提供了一个可复用的人类PH单细胞参考框架，并通过PH-Map支持未来PH单细胞数据的快速、标准化和分层注释。该资源有助于在后续研究中更清楚地区分人类PH中的共同重构程序、亚型特异性细胞状态以及模型系统相关现象，为候选细胞状态和通路的后续验证提供依据。
需要指出的是，本研究主要基于公开人类PH单细胞数据，且人类PH样本多来源于肺移植或终末期手术标本，因此更能反映晚期肺血管重构状态。由于部分公开数据缺乏完整的血流动力学、临床分期和精确解剖取材信息，本图谱更适合用于细胞状态和通路层面的比较，而不应被直接解释为组织层面的细胞总量、细胞密度或空间分布。未来，随着更多具有完整临床信息、空间定位信息和病程信息的人类PH数据加入，该图谱有望继续迭代，为PH发生发展和亚型异质性研究提供更精细的参考。
参考文献：Feng H, Lai J, Yang X, Cui X, Mo S, Feng Y, Chen Q, Zhong B, Lu W, Chen Y, Yang K, Wang J. Integrated Single-Cell Atlas Reveals Cross-Subtype Heterogeneity in Human Pulmonary Hypertension. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2026 May 14. doi: 10.1161/ATVBAHA.126.324594. Epub ahead of print. PMID: 42131915.
原文链接：
https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/ATVBAHA.126.324594