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奥希替尼是 EGFR 突变阳性（EGFRm）非小细胞肺癌（NSCLC）一线治疗的标准方案。明确奥希替尼治疗进展后患者的肿瘤分子特征，有助于指导后续最优二线治疗。ORCHARD 研究（NCT03944772）是一项 Ⅱ 期生物标志物导向研究，纳入一线奥希替尼治疗后进展的 EGFRm NSCLC 患者，根据进展后肿瘤组织的二代测序（NGS）分子特征分组接受对应治疗。本研究报道对基线肿瘤组织与血浆样本开展的预设探索性分析结果，评估组织与血浆 NGS 检出的一线奥希替尼耐药机制，并分析组织与血浆 NGS 结果的一致性。
本研究获得包含组织样本（n=400）与血浆样本（n=191）基因组数据的完整数据集，可表征一线奥希替尼治疗后的组织基因组图谱。86% 的肿瘤存在 TP53 与 MDM2/4 变异，且二者互斥。联合组织与血浆基因组分析，87% 的样本检出耐药变异，46% 存在多重耐药变异。组织学转化肿瘤中常检出 PI3K 通路、SOX2 与 MYC 变异。此外，观察到携带 L858R 与 19 号外显子缺失（Ex19del）的肿瘤中，EGFR 共突变模式存在差异。
本项全面分析揭示一线奥希替尼治疗存在潜在异质性耐药，为采用广谱活性联合方案改善患者预后提供理论依据。
研究背景
奥希替尼是第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR‑TKI），可强效、选择性抑制 EGFR‑TKI 敏感突变与 EGFR T790M 耐药突变，在 EGFR 突变阳性（EGFRm）非小细胞肺癌（NSCLC）中已证实疗效。基于 Ⅲ 期 FLAURA 研究中观察到的显著无进展生存与总生存获益，奥希替尼单药已成为 EGFRm 晚期 NSCLC 一线治疗的标准方案。
尽管奥希替尼疗效确切，但多数患者最终会出现疾病进展，因此明确进展后患者的肿瘤分子特征，对指导最优二线治疗至关重要。既往针对一线与二线奥希替尼耐药机制的 Ⅲ 期研究分析显示，MET 扩增与继发性 EGFR 突变（如 EGFR C797S）是最常见的基因组变异。此类分析基于奥希替尼治疗前与进展 / 停药后配对血浆样本的循环肿瘤 DNA（ctDNA）NGS 检测。然而，ctDNA 分析存在关键局限，包括无法检测组织学转化，且对拷贝数变异的检测灵敏度低于组织分析。对一线奥希替尼治疗前与治疗后配对肿瘤组织样本的分析发现，15% 的患者发生组织学转化，主要转化为鳞癌。此外，早期奥希替尼耐药机制研究仅分析血浆或组织样本，限制了两种检测方法的对比。
ORCHARD 研究（NCT03944772）是一项全球性 Ⅱ 期、开放标签、多中心、生物标志物导向的平台研究，针对一线奥希替尼单药治疗后进展的 EGFRm 晚期 NSCLC 患者，旨在评估一线奥希替尼的耐药机制，以及基于耐药机制制定的后续治疗方案的疗效。本文报道 ORCHARD 研究基线肿瘤组织与血浆样本的探索性分析结果，同时评估血浆与组织检测方法的一致性。患者在筛选期提供肿瘤组织用于基因组谱分析，在第 1 周期第 1 天提供血浆样本。组织样本采用 FoundationOne CDx panel（Foundation Medicine 公司）分析，血浆样本采用 GuardantOMNI 500 基因 panel（Guardant Health 公司）分析。允许开展组织的局部 NGS 分析，但需通过回顾性中心 NGS 验证。
研究结果
患者特征：
共有 706 例患者进行 ORCHARD 研究筛选；483 例患者在筛选期提供组织样本，247 例接受研究药物的患者提供血浆样本用于 NGS 检测。中心 NGS 检测可评估的组织与血浆结果分别来自 400 例与 191 例患者（数据截止日期 2024 年 10 月 22 日；图 1A）。测序失败的最常见原因包括组织样本不足或 DNA 产量不足。共有 157 例患者具有配对的组织与血浆肿瘤生物标志物数据。434 例具有肿瘤组织或血浆生物标志物结果的患者基线特征见表 1。患者中位年龄 62 岁，63% 为女性，52% 为白人，43% 为亚洲人，40% 无吸烟史。
图1
表1
基于组织 NGS 的一线奥希替尼耐药机制基因组图谱：
通过 NGS 与组织学评估检出的基于组织的一线奥希替尼耐药机制见图 1B 与图 2A（按频率）。多数组织样本（60%）存在已知且潜在可靶向的基因变异，25% 检出多重耐药机制。MET 变异（包括扩增、融合、突变与剪接突变）是最常见的耐药机制，在 19%（76/400）的组织样本中检出，其中扩增是最常见的 MET 变异（18%；71/400）。还检出 1 例 MET 重排（14‑21 号外显子内基因内重复）、3 例 MET 激酶结构域突变（L1195V、H1094Y、D1228H）与 1 例剪接位点变异。继发性 EGFR 耐药突变（C797X、L718X、G724S）与 EGFR 扩增分别在 11%（45/400）与 35%（138/400）的组织样本中检出。2%（7/400）的组织样本检出 EGFR T790M 突变，1 例组织样本同时存在 C797S 与 T790M。
图2
NKX2‑1 扩增与 BRAF 变异分别在 21%（82/400）与 8%（30/400）的组织样本中检出（分别在 19 例与 11 例样本中检出 BRAF 融合与 V600E 突变）。其他潜在可靶向变异包括 ERBB2 变异、RAS 突变、FGFR1/2/3 融合，发生率均较低，分别为 4%（17/400）、2%（8/400）、2%（6/400）。RBM10 变异、ERBB2 扩增、ERBB2 突变分别在 6%（25/400）、3%（13/400）、2%（6/400）的组织样本中检出。86%（343/400）的组织样本检出 MDM2/4 或 TP53 变异（图 1B）。多数患者中，MDM2/4 扩增与 TP53 变异互斥（P<0.001；图 1C）。
19 例（5%）组织样本发生组织学转化：13 例转化为小细胞肺癌，2 例为大细胞癌，1 例为大细胞神经内分泌癌，2 例为腺鳞癌，1 例为鳞癌。转化样本中 PI3K 通路变异（包括 PIK3CA 与 PTEN 变异）发生率高；19 例样本中 9 例（47%）存在功能性突变（图 1D）。SOX2 与 MYC 扩增各在 2 例（11%）转化样本中检出，且与 PI3K 通路变异互斥。此外，RB1 功能缺失与 TP53 突变在转化样本中富集（68% 的转化样本（13/19）同时存在，而非转化样本为 10%（40/381）；P<0.0001）。所有样本的 TMB 整体较低；但组织学转化肿瘤的中位 TMB 显著高于腺癌肿瘤（2.52 vs. 3.78；P=0.045；图 1E）。
基于血浆 NGS 的一线奥希替尼耐药机制基因组图谱：
通过 NGS 检出的基于血浆的一线奥希替尼耐药机制见图 2A（按频率）与图 2B。191 例血浆样本中，共计 23 例（12%）未检出 EGFR 敏感突变。与组织样本类似，MET 变异与继发性 EGFR 耐药突变是最常见的耐药机制，分别在 17%（32/191）与 21%（41/191）的血浆样本中检出。多数 MET 变异为扩增（16%；30/191）。NKX2‑1 扩增与 RB1 缺失各在 6%（12/191）的血浆样本中检出。共计 27% 的样本检出多重耐药机制。
19 例组织学转化的组织样本中，10 例有配对血浆样本。血浆样本中耐药变异共存发生率（50%；5/10）高于组织样本（16%；3/19）（图 1D）。10 例血浆样本中，4 例（40%）检出 PI3K 通路变异或 MYC 扩增。与组织样本一致，RB1 功能缺失与 TP53 突变在组织学转化的血浆样本中富集，检出率分别为 40% 与 100%。
组织与血浆 NGS 的一致性：
157 例配对组织与血浆样本通过 NGS 检出的生物标志物状态见图 2A（按频率）与图 2C。4 例配对样本（3%）通过组织或血浆 NGS 均未检出 EGFR 突变，提示这些患者可能错误入组 ORCHARD 研究，或在一线奥希替尼治疗后出现独立新发病灶。这 4 例样本中，1 例存在 KRAS G12D 突变，1 例存在 ALK‑EML4 融合。单独采用组织 NGS 或血浆 NGS，分别有 25% 与 27% 的样本检出多重耐药机制，联合组织与血浆 NGS 后该比例升至 46%。此外，联合组织与血浆 NGS 时，仅 14%（22/157）的样本未检出已知耐药变异（图 2A）。
组织与血浆 NGS 对 EGFR 点突变 / 插入缺失突变的一致性较高，仅血浆 NGS 未检出 EGFR 突变的患者除外。153 例检出 EGFR 敏感突变或非典型 EGFR 突变的样本中，87%（133/153）在组织与血浆中均检出，12%（19/153）仅在组织中检出，1%（1/153）仅在血浆中检出。扩增在组织样本中检出频率通常更高；76 例通过任一方法检出 EGFR 扩增的样本中，30%（23/76）在组织与血浆中均检出，53%（40/76）仅在组织中检出，17%（13/76）仅在血浆中检出。类似地，41 例检出 MET 扩增的样本中，27%（11/41）在组织与血浆中均检出，46%（19/41）仅在组织中检出，27%（11/41）仅在血浆中检出。EGFR 变异等位基因频率（VAF）低（<5%）的血浆样本 NGS 未检出组织中检出的 MET 扩增（分别为 1 例 vs. 14 例；总体一致性比例（OPA）85%；阳性预测值（PPV）0%；阴性预测值（NPV）85%；图 2D）。无论 EGFR VAF 如何，组织 NGS 检出 MET 扩增的能力均优于血浆 NGS（30 例 vs. 22 例；OPA 81%；PPV 50%；NPV 86%）；但 EGFR VAF 高（≥5%）的血浆样本 NGS 检出 MET 扩增的能力优于组织 NGS（21 例 vs. 16 例；OPA 75%；PPV 52%；NPV 87%）。BRAF 变异的检测一致性较低：22 例样本中 3 例（14%）在组织与血浆中均检出，8 例（36%）仅在组织中检出，11 例（50%）仅在血浆中检出。RAS 突变最常见仅在血浆中检出（10 例样本中 5 例）。相反，尽管 ALK 融合与 ERBB2 突变发生率低，其组织与血浆检测一致性分别为 60% 与 40%。
非典型与继发性耐药 EGFR 突变：
组织中检出的非典型与继发性耐药 EGFR 突变频率为：C797S 8%，E711Q 与 G724S <1%（图 3A）。共计 24%（94/400）的组织样本检出至少 1 个非典型或继发性耐药 EGFR 突变。最常见的已知继发性耐药 EGFR 突变为 C797S 与 L718X（图 3B）。L718X 仅与 L858R 共存（13/13，100%），而 C797X 主要与 19 号外显子缺失（Ex19del）共存（23/31，74%；图 3C）。
图3
非典型 EGFR 敏感突变（如 L861Q）倾向于单独发生，其他突变（包括 E709X、S768I）与其他非典型或 EGFR 敏感突变共存（图 3B）。与常见 EGFR 突变共存（不含 T790M）的非典型 EGFR 敏感突变主要与 L858R 共存（20/21，95%），而非 Ex19del（1/21，5%；图 3C）。无其他变异与非典型 EGFR 突变或 EGFR 敏感突变呈现强共存模式。31 例检出非典型 EGFR 突变且无其他 EGFR 敏感突变的组织样本中，52%（16/31）未检出已知耐药突变。
所有血浆样本中检出至少 1 个非典型或继发性耐药 EGFR 突变的比例（30%；58/191）与所有组织样本（24%；94/400；图 3B）相近。但血浆样本中继发性 EGFR 耐药突变的发生率（21%）高于组织样本（11%；图 1B 与图 2B）。4%（8/191）的血浆样本中检出多克隆 EGFR 与多克隆 PIK3CA/PTEN 耐药突变。7 例样本存在多个 C797S 克隆，其中 1 例同时存在 L718Q 突变。与组织样本一致，2%（4/191）的血浆样本检出 EGFR T790M 突变。11 例检出非典型 EGFR 突变且无其他 EGFR 敏感突变的血浆样本中，64%（7/11）未检出已知耐药突变。
讨 论
本项对 ORCHARD 研究奥希替尼治疗后组织与血浆样本的探索性分析，提供了迄今评估一线奥希替尼组织与血浆耐药机制的最大数据集。MET 变异与继发性 EGFR 突变是组织（分别为 19% 与 11%）与血浆样本（分别为 17% 与 21%）中最常见的耐药机制。这与既往报道一致，既往研究在奥希替尼治疗后样本中检出 MET 扩增的比例最高达 18%。ORCHARD 研究中继发性 EGFR 耐药突变的检出率高于 FLAURA 研究血浆样本 NGS 分析结果（6%），但与 ELIOS 研究数据一致（奥希替尼治疗后组织样本中为 14%）。仅基于 ctDNA NGS 的 MET 扩增状态解读需谨慎，因本文与既往研究均证实其灵敏度较低，且与 ctDNA 含量相关。本分析中 EGFR 扩增也较为常见（34% 的组织样本）；有趣的是，ELIOS 研究显示奥希替尼治疗前与治疗后组织样本中 EGFR 扩增的发生率相似，提示该变异在奥希替尼耐药中不发挥关键作用。
本分析中 21% 的组织样本检出 NKX2‑1 扩增，已有研究证实其可介导 EGFRm NSCLC 的肿瘤发生并赋予奥希替尼耐药性。6% 的组织样本检出 RBM10 变异，已有研究证实其可限制 EGFR 抑制剂的疗效，且与不良预后相关。EGFRm 肺癌中 RB1 与 TP53 变异共存与组织学转化风险升高相关。值得注意的是，NKX2‑1 扩增与 RB1 缺失也各在 6% 的血浆样本中检出。ELIOS 研究血浆样本中未检出这些变异，可能因 GuardantOMNI 检测的基因 panel 大于 ELIOS 研究采用的 Guardant360 检测。ORCHARD 研究中极少检出 EGFR T790M 突变（组织与血浆均为 2%）。FLAURA 研究中未观察到 T790M 介导的一线奥希替尼获得性耐药，近期报道提示这些 T790M 突变可能源于发育嵌合，而非获得性耐药。有趣的是，MDM2/4 与 TP53 变异在很大程度上互斥，这与 MDM2/4 在野生型 p53 降解中的作用一致。多数（86%）肿瘤检出 MDM2/4 或 TP53 变异，提示一线奥希替尼治疗后多数 NSCLC 肿瘤中 p53 通路受抑制。
157 例配对组织与血浆样本具备 NGS 数据，可全面评估两种检测方法。组织样本肿瘤含量高，灵敏度更高，且是评估组织学转化的必需手段。相反，血浆肿瘤含量低（因此灵敏度较低），但可能提供多个病灶的耐药机制信息（肿瘤异质性）。与此一致，组织与血浆 NGS 检测 EGFR 敏感突变的一致性高，这符合克隆驱动突变的特征。但扩增在组织中更常检出，反映低肿瘤含量背景下基于血浆的拷贝数检测难度较大。组织 NGS 还可检出 EGFR VAF≤5% 的血浆样本中无法检出的 MET 扩增，提示对于 ctDNA 组分低的患者，组织 NGS 检测拷贝数变异的灵敏度更高。但 EGFR VAF＞5% 的血浆样本 NGS 检出 MET 扩增的能力优于组织，提示血浆分析可揭示亚克隆 MET 扩增的细节。尽管如此，基于组织的 IHC 与 FISH 检测仍是鉴定 MET 过表达与扩增的金标准方法，目前正在开展的临床试验中对此进行探索。组织与血浆 NGS 检测 BRAF 变异与 RAS 突变的一致性较低，这些变异在血浆中检出频率更高。此外，尽管组织中检出的变异（如 MET 扩增、BRAF 变异、ERBB2 扩增）通常互斥，但血浆样本中并非如此。这些发现进一步证实血浆 NGS 在鉴定亚克隆耐药与肿瘤异质性方面的优势。总体而言，本数据提示组织与血浆 NGS 为检测奥希替尼耐药机制提供互补信息。事实上，联合两种检测方法时，仅约 14% 的患者未检出已知耐药变异，而单独采用组织与血浆检测时该比例分别为 29% 与 41%。此外，联合组织与血浆样本 NGS 检出 46% 的样本存在多重耐药机制，而单独采用组织与血浆检测时该比例分别为 25% 与 27%。该结果与指南趋势一致，指南正逐步推荐采用组织和 / 或血浆分子检测。
值得注意的是，对于非典型 EGFR 突变患者（无常见 EGFR 突变），组织（57%；16/28）与血浆（64%；7/11）分析检出已知耐药变异的比例均较低。有趣的是，非典型突变与 L718X 继发性耐药突变通常主要与 L858R 共存，而非 Ex19del。但特定继发性耐药突变（包括 C797X）倾向于与 Ex19del 共存。美国一项真实世界研究在评估奥希替尼治疗后耐药的 EGFRm NSCLC 患者中，也报道了类似的继发性 EGFR 突变模式。除 EGFR 扩增与 RBM10 变异在 L858R 肿瘤中发生率高于 Ex19del 肿瘤外，所有其他耐药变异在携带 L858R 与 Ex19del 的组织样本中发生率相似。
总体而言，19 例（5%）样本出现组织学转化，主要转化为小细胞癌，该比例低于既往分析报道（10%‑15%），可能因部分中心对样本进行预筛选，转化病例未提交研究检测。所有样本的 TMB 整体较低，与既往 EGFRm NSCLC 患者中的观察结果一致。但组织学转化样本的 TMB 水平高于腺癌组织样本。此外，组织学转化肿瘤中 PI3K 通路变异发生率高，且 RB1 功能缺失与 TP53 突变富集。三分之二的转化样本检出 PI3K、SOX2 或 MYC 变异，支持这些变异在组织学转化中的潜在作用。该突变谱与既往组织学转化肿瘤的报道一致。
解读本数据时需考虑若干局限性。由于分析仅限于奥希替尼治疗后的样本，无法区分既往存在的变异与获得性变异。此外，ORCHARD 研究的患者人群可能因临床试验转诊存在偏倚，可能过度代表存在罕见耐药机制的患者，而未充分代表存在 ORCHARD 研究中无靶向治疗对应的变异的患者，或转化为鳞癌或小细胞肺癌的患者。此外，仅 24 例（13%）血浆样本未检出敏感 EGFR 突变与非典型 EGFR 突变，略低于 FLAURA 研究报道（19%），提示本分析可能纳入更多病情更侵袭或肿瘤体积更大的患者，可能与组织活检入组标准相关。ORCHARD 研究设计不断完善，随着新治疗方案与标志物的发现增设研究模块，因此本分析可能无法完全代表奥希替尼治疗后普通患者人群。尽管如此，本分析在大型数据集中全面概述了通过组织与血浆 NGS 检出的耐药机制。
本分析中鉴定的多数耐药机制具有可靶向性；一项针对一线奥希替尼治疗后进展患者的回顾性分析显示，基于进展后活检结果调整后续治疗与进展后生存期改善相关，凸显明确耐药机制并据此调整治疗的重要性。目前，一线奥希替尼治疗后进展患者的治疗选择包括铂类双药化疗与阿米万他单抗联合卡铂、培美曲塞。但一线奥希替尼治疗后进展的患者仍需更多靶向治疗选择，该人群的成功治疗仍具挑战性。Ⅱ 期 SAVANNAH与 INSIGHT‑2研究、Ⅲ 期 SACHI 研究观察到，奥希替尼联合 MET 抑制剂在一线奥希替尼或其他 EGFR‑TKI 治疗后进展、肿瘤携带 MET 变异的患者中展现出可观疗效，评估奥希替尼联合赛沃替尼的 Ⅲ 期确证研究 SAFFRON 正在开展中。对于无可靶向耐药机制的患者，ORCHARD 研究生物标志物不匹配模块中观察到奥希替尼联合达托单抗德鲁替康疗效良好；Ⅲ 期 TROPION‑Lung 15 研究将进一步探索该联合方案。ORCHARD 研究正在开展的模块将提供更多奥希替尼进展后特定生物标志物导向治疗的疗效与安全性数据。未来分析还应考虑多克隆耐药及其对治疗结局的影响。
参考文献：
Yu HA, Tang KH, Markovets AA, Hartmaier R, Smith PE, Cho BC, De Langen AJ, Goldberg SB, Goldman JW, Le X, Iwama E, Cosaert J, Riess JW, Piotrowska Z. Genomic Profiling of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation-Positive Non-Small Cell Lung Cancer Post-Progression on First-Line Osimertinib: Phase II ORCHARD Study. Clin Cancer Res. 2026 Mar 6. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-25-4540. Epub ahead of print. PMID: 41790029.