中枢神经系统（CNS）肿瘤指起源于中枢神经系统内的组织或结构的一组良恶性疾病，病变主要位于颅内或椎管内，具有较高的致残率和致死率，因此在疾病早期对患者进行精准诊断有助于更好地制定治疗策略并改善预后。

2021 年世界卫生组织（WHO）CNS分类将DNA甲基化检测列为关键诊断依据，目前已成为多种肿瘤亚型分类的核心标准。但当前主流的肿瘤甲基化分析依赖芯片技术（如Illumina EPIC），需通过专科实验室进行批量检测，诊断周期较长；后续还需要额外进行基因panel、融合基因等补充检测，导致诊断流程碎片化严重；并且术中仅能通过组织形态学进行初步判断，难以满足精准医疗的需求。

为解决上述难题，英国诺丁汉大学研究人员及其合作团队开发了一种名为ROBIN（Rapid nanopore brain intraoperative classification）的新方法，其整合了多个分子分析流程，不仅能在术中实现基于甲基化组的CNS肿瘤分类，还能通过单次检测在次日生成全面的分子分型图谱，为临床决策提供支持。通过优化文库制备流程与自适应采样策略，ROBIN将术中诊断时间缩短至2小时，并在前瞻性验证队列中达到90%的诊断一致性。总之，ROBIN提升了诊断效率并实时提供了临床可操作的分子信息，有望革新CNS肿瘤诊断标准。

ROBIN基于Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司PromethION测序仪，通过改进转座酶建库技术，实现了从组织取样到测序文库制备的90分钟快速处理；整合了多个分类器，可同步检测肿瘤样本中的单核苷酸变异（SNV）、拷贝数变异（CNV）、结构变异（SV）及 MGMT 启动子甲基化状态及候选融合基因；并整合了三种甲基化分类器（Sturgeon、CrossNN、随机森林），以提高术中甲基化组分类性能。特别地，ROBIN中还运用了ONT的自适应采样技术，允许在测序运行期间对感兴趣区域进行选择性测序。基于上述流程设计，ROBIN在单次检测中便可实现术中实时甲基组分类与24小时内综合分子分析。

图1.术中文库制备和测序工作流程

具体而言，ROBIN超快速肿瘤诊断流程包括：在手术台直接采集患者肿瘤样本；使用Qiagen的QiaAmp Fast DNA组织试剂盒快速提取DNA；DNA剪切后，通过改良的ONTDNA超长片段测序试剂盒V14进行文库制备；然后使用PromethION设备和R10.4.1流通池对文库进行测序，加载文库后5分钟即启动测序，最长运行24小时；通过MinKnow软件进行实时碱基识别，并结合自适应靶向测序（Readfish工具），聚焦3,487个目标区域。

此外，ROBIN还通过图形界面实时整合多模态数据，同步展示甲基化分类概率、CNV图谱、SNV注释及融合基因信号，使病理学家可在测序过程中动态解读数据。

接下来，研究团队在50例前瞻性术中病例（含胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤等）及30例回顾性病例中评估了ROBIN的性能，并将其与标准甲基化芯片分析和最终综合诊断进行了比较。结果显示，相比标准流程，ROBIN的诊断周转时间短至两小时，可在测序后几分钟内生成可靠的肿瘤分类，并能够在24小时内提供完整的综合诊断。

在50例患者中，有38个患者（76%）在术中测序1小时得到准确甲基化分类（由两个或多个分类器进行可靠分类）；45名患者（90%）在测序24小时后被正确分类，分类结果与最终综合诊断结果一致，但传统诊断方法平均周转时间为33天。

图2. ROBIN预测肿瘤类型

除甲基化分类外，ROBIN在24小时内生成了全面的综合诊断，包括①CNV：成功检测胶质母细胞瘤中7号染色体扩增/ 10号染色体缺失、少突胶质细胞瘤1p/19q共缺失等特征性改变，与芯片结果一致性达100%；②SNV：在少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤中准确识别93%IDH1/2突变，并检测到TERT启动子突变、TP53突变等关键驱动变异；③SV：鉴定出MYB-EYA4-HBS1L 融合、VGLL3-SAM13-CHD7等新型复杂融合事件；④MGMT启动子甲基化：与芯片结果一致性达95.7%，为胶质母细胞瘤的替莫唑胺化疗敏感性评估提供实时依据。

此外，ROBIN的单样本成本降至400-450英镑，这一价格“接近” 单一基于芯片的检测价格，但该方法后续可取代多种检测，因此更具成本效益。

图3. ROBIN次日报告中捕获的其他分子特征

据了解，自最初的研究以来，研究团队已经使用ROBIN方法分析了125多个样本；目前正计划整合荷兰乌得勒支大学开发的Sturgeon分类器、德国海德堡大学开发的MNP-Flex分类器，进一步优化ROBIN诊断性能。文章通讯作者Loose教授表示，这种跨机构的协作创新将最终惠及全球患者。

综上所述，ROBIN技术通过纳米孔测序的单平台整合能力，突破了传统中枢神经系统肿瘤诊断的时间与技术瓶颈：其术中实时分类能力使外科决策从经验驱动转向分子引导，尤其适用于立体定向活检等小样本场景；24小时内获取融合、突变等完整分子谱，可加速靶向治疗入组。该技术的成功验证也为其他癌种的术中分子诊断提供了借鉴，加速精准医学在外科场景中的落地。未来，ROBIN有望推动中枢神经系统肿瘤诊断向 “床边即时分子病理” 转型，缩短患者等待时间并优化治疗方案。

参考文献：

1.https://www.genomeweb.com/sequencing/new-nanopore-method-enables-intraoperative-classification-rapid-molecular-profiling

2.Simon Deacon, Inswasti Cahyani, Nadine Holmes Neuro-Oncology, et al. ROBIN: A unified nanopore-based assay integrating intraoperative methylome classification and next-day comprehensive profiling for ultra-rapid tumor diagnosis. noaf103, doi.10.1093.

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