多项临床试验探索了循环肿瘤DNA（ctDNA）在结直肠癌中指导辅助化疗（ACT）的作用。及时开始ACT需要尽早进行ctDNA检测，但术后游离DNA（cfDNA）和ctDNA动态变化的影响尚不清楚，特别是在一些检测中为了降低成本限制输入量时。本研究对比了术后第14天和第30天的ctDNA检测结果，比较了全样本分析和对cfDNA输入量进行限制的情况，并评估了单次和两次时间点评估对ACT分配的指导。2019 - 2023年，纳入了611例I - III期结直肠癌患者。在术前、术后约第14天和第30天采集血液样本。使用数字PCR评估cfDNA水平，使用肿瘤知情数字PCR或靶向测序评估ctDNA，分析8mL血浆中提取的所有cfDNA。尽管85%的术后第14天样本cfDNA水平升高，但两个时间点的检测性能相当（灵敏度分别为31%和32%；特异性均为98%）。50ng的cfDNA输入量上限会降低ctDNA检出概率，影响78%的第14天样本和65%的第30天样本。在两个时间点，ctDNA检测均能预测复发（术后第14天：HR=9.0，95%CI 5.5 - 14.8；术后第30天：HR = 12.5，95%CI 7.6 - 20.4）。在ctDNA阳性且复发的患者中，74%的患者两个样本均检测到ctDNA。术后第14天到第30天ctDNA水平升高与更短的复发时间相关（皮尔逊相关系数R=-0.63，P=0.003）。结合两个时间点的检测可提高灵敏度（至36%），使80%的患者能够更早开始ACT。本研究表明，早期ctDNA采样可行且具有高度的预后价值。后期补充检测可能提高灵敏度，同时让大多数ctDNA阳性患者尽早开始ACT。

研究背景

目前，多项临床试验正在探索利用循环肿瘤DNA（ctDNA）检测结直肠癌（CRC）的残留病灶，并指导辅助化疗（ACT）的应用 。为了指导ACT的合理使用，ctDNA检测结果必须尽早得到，才能保证ACT的有效性。多项研究和荟萃分析表明，早期开始ACT可提高疗效。因此，大多数临床指南建议在术后8周内开始ACT，部分指南建议最早在术后4周开始。相应地，为了让ctDNA在未来ACT患者的筛选中发挥作用，至关重要的是ctDNA分析能够在术后4周内完成，以满足当前临床指南的要求。因此，了解采样时间对ctDNA检测预后准确性的影响至关重要。到目前为止，唯一一项已发表的关于ctDNA指导ACT分配的随机试验显示，ACT的启动时间从标准治疗组的约8周推迟到ctDNA指导组的约12周，因为ACT是在术后4周和7周采集样本进行ctDNA分析后开始的。或许，通过更早采样能够实现更早的ACT给药。此外，在两个早期时间点而非一个时间点进行ctDNA分析的价值尚未得到验证。

先前的研究表明，术后4周内，游离DNA（cfDNA）水平升高。对于对cfDNA输入量有限制的ctDNA检测方法而言，这可能导致仅能分析部分样本，增加ctDNA检测结果假阴性的风险。相反，如果不限制输入量，分析大量DNA时，可能会增加ctDNA检测结果假阳性的风险，因为将正常cfDNA片段误判为ctDNA片段（例如，因聚合酶链式反应（PCR）错误）的风险与所检测的正常cfDNA片段数量成正比。除了cfDNA动态变化外，ctDNA水平的改变也可能影响检测的可靠性。在监测中，ctDNA水平呈指数增长。因此，推迟血液采样可能会使ctDNA水平更高，从而提高检出率。在本研究中，我们对611例CRC患者术前、术后约14天和术后约30天采集的配对样本中的cfDNA和ctDNA水平的术后变化进行了研究和特征分析。此外，我们还探究了单样本和双样本检测策略中ctDNA检测的预后准确性，以评估哪种策略最适合指导ACT的分配。

研究结果

患者队列

本研究人群包括611例接受根治性手术的UICC I - III期结直肠癌患者。所有患者均未接受新辅助治疗，101例（17%）接受了辅助治疗。所有患者在术前、术后约14天（d14）和术后约30天（d30）采集了配对血浆样本（均在辅助化疗开始前采集）（图1A），且至少进行了一年的影像学随访（表1）。

图1

表1

术后cfDNA短暂升高

为评估手术创伤对cfDNA水平的影响，测定了术后cfDNA水平的升高情况（图1B）。由于患者之间的cfDNA水平存在较大差异，因此对每位患者的测量值均根据术前水平进行了标准化。85%的患者术后（d14）cfDNA水平升高（图1B + C）。d14样本相对于术前水平的中位变化倍数为1.8（四分位距（IQR）：1.3 - 2.8），d30样本的中位变化倍数显著降低，为1.3（IQR：0.9 - 1.9）（图1C，P<2.2e - 16）。根据对数线性回归分析，术后38天cfDNA水平恢复至术前水平（图1B）。在配对样本中，74%的患者d14至d30期间cfDNA水平下降，且cfDNA下降速率与初始cfDNA升高幅度成正比（图1D）。因此，与初始cfDNA升高幅度较小的患者相比，初始cfDNA水平大幅升高的患者其cfDNA下降速度更快。cfDNA水平平均每天下降3.2%（IQR：- 0.2 - 8.4%）。

手术创伤程度可能影响cfDNA升高情况

611例患者中有581例患者可获取手术方式和术后并发症的详细信息。手术方式（开放手术与微创手术）对cfDNA升高无影响。我们进一步分析了术后有并发症患者的cfDNA水平（图1E）。与无并发症患者的cfDNA升高幅度（中位1.7倍，IQR为1.2 - 2.6；图1E）相比，d14时轻度并发症（Clavien - Dindo 1 - 2级）患者的cfDNA升高幅度更大（中位2.1倍，IQR为1.8 - 3.7），严重并发症（Clavien - Dindo分级3 - 4级）患者的cfDNA升高幅度还要大（中位3.0倍，IQR为2.3 - 5.5）。在d30时，只有严重并发症患者的cfDNA水平显著升高（中位1.9倍，IQR为1.4 - 2.7；图1E）。因怀疑并发症而进行的额外手术在d30时也显示出cfDNA水平有升高趋势（n = 13，d30中位1.7倍，IQR为1.1 - 2.5，P = 0.07）。在各类并发症中，吻合口漏、肠梗阻和造口并发症似乎对额外cfDNA升高的影响最大。

cfDNA水平对ctDNA检测的影响

所有样本均采用ddPCR（n = 490例患者）或靶向测序（n = 121例患者）进行ctDNA检测。两种检测方法的术前检出水平相当，因此后续对术后ctDNA检测的分析未根据检测方法进行分层。

为评估术后cfDNA水平升高是否会导致假阳性ctDNA结果，我们比较了未复发患者（n = 537）中ctDNA阴性（视为真阴性）和ctDNA阳性（视为假阳性）样本的cfDNA水平（图2A）。为简化分析，所有来自未复发患者的ctDNA阳性样本均被计为假阳性，尽管其中部分样本（d14有2/12，d30有3/9）随后接受了辅助化疗，这可能清除了患者体内的真阳性信号。无论样本采集时间如何，ctDNA阳性和ctDNA阴性样本的cfDNA水平无差异（图2A）。同样，我们对复发患者（n = 74）进行了研究，以查看cfDNA水平升高是否会导致假阴性ctDNA结果。再次发现，无论样本采集时间如何，ctDNA阳性（视为真阳性）或ctDNA阴性（视为假阴性）患者的cfDNA水平无差异（图2A）。此处使用的ctDNA检测方法可分析8mL血浆中的所有cfDNA。由于许多ctDNA检测方法对分析的cfDNA量有限制，我们探究了其对ctDNA检测的潜在影响（图2B + C）。我们发现，78%的d14样本会受到50ng输入量上限的影响，43%会受到100ng输入量上限的影响（图2B）。在d30样本中，这一比例分别降至65%和21%。我们模拟了在进行ctDNA检测时，相对于分析整个样本，采集到足够ctDNA的概率，发现限制cfDNA输入量会降低采样概率，从而降低检出概率（图2C）。

图2

术后ctDNA变化

我们在两个术后样本中至少有一个为ctDNA阳性的患者亚组（n = 45）中，比较了d14和d30时的ctDNA检测结果。在未复发患者（n = 18）中，大多数患者（15/18）术后两个样本中仅有一个呈阳性信号（图2D）。相反，在复发患者（n = 27）中，大多数患者（20/27）两个样本的ctDNA结果均为阳性（图2D）。此外，两个样本均阳性的患者ctDNA水平高于仅一个样本呈阳性的患者。为研究术后ctDNA的动态变化，我们在d14和d30时ctDNA均阳性的患者中，通过对数线性回归的斜率来研究ctDNA水平随时间的变化。我们观察到，复发患者（中位增长1.8%/天）的增长相比未复发患者（中位- 2.6%；图2E）更为明显，不过由于观察数据较少，未进行统计学检验。在复发患者中，我们发现ctDNA每日变化与发现复发时间呈负相关（皮尔逊相关系数R = - 0.63，P = 0.003，图2E）。

我们的分析表明，d14和d30时的ctDNA检测均能预测复发（d14，HR = 9.0，95%CI为5.5 - 14.8，P<0.001，图2F；d30，HR = 12.5，95%CI为7.6 - 20.4，P<0.001，图2G）。对于d14样本，ctDNA阴性患者的12个月无复发生存率（RFS）为99%（95%CI为96 - 99%），ctDNA阳性患者为66%（95%CI为51 - 83%）；ctDNA阴性患者的36个月RFS为84%（95%CI为80 - 89%），ctDNA阳性患者为28%（95%CI为14 - 55%）。对于d30样本，ctDNA阴性的12个月RFS为98%（95%CI为96 - 99%），ctDNA阳性患者为63%（95%CI为49 - 82%）；ctDNA阴性患者的36个月RFS为85%（95%CI为81 - 90%），ctDNA阳性患者为14%（95%CI为4 - 42%）。

前瞻性流程中的采样策略

我们希望评估四种不同的采样策略在前瞻性流程中的预后能力和最早开始ACT的时间：1）单个早期样本（d14）；2）单个晚期样本（d30）；3）若早期或晚期样本ctDNA阳性，则开始ACT（Either，两者其一）；4）仅当两个样本ctDNA均呈阳性时，才开始ACT（Both，两者均）。d14策略和d30策略的灵敏度相当（d30为32%，d14为31%），特异性相同（均为98%；图3A）。双样本“两者其一”策略的灵敏度较高（36%），但特异性较低（97%）。双样本“两者均”策略提高了特异性（99%），但降低了灵敏度（27%）。我们探究了采样策略的灵敏度是否受后期诊断出复发部位的影响。双样本“两者其一”策略灵敏度较高主要由肝转移驱动，其灵敏度从单时间点策略的35%提高到“两者其一”策略的47%，而“两者均”策略的灵敏度则降至24%。所有策略在检测多个转移部位的复发时表现最佳（灵敏度为42% - 45%），在检测肺、腹膜转移或局部复发时表现最差（灵敏度为0% - 9%）。我们使用F1评分来评估整体性能，将灵敏度和阳性预测值（PPV）结合为一个指标，发现“两者其一”策略和d30策略的得分最高（均为45%；图3A）。我们的数字PCR ctDNA分析中部分（376/611）是前瞻性进行的，用于筛选进入IMPROVE - IT试验（ClinicalTrials.gov标识符NCT03748680）的患者。对于这些患者，我们分析了d30样本从采集到获得ctDNA结果的时间（中位13天，IQR 10 - 19天），因为d14样本是同时进行分析的。请注意，这仅反映了ctDNA分析的时间，不包括上游组织分析的时间。基于此，我们模拟了上述四种策略的响应时间（图3B），假设在采样时有肿瘤分析信息。为了尽早开始ACT，d14策略最为理想，术后第5周前100%有ctDNA结果，其次是“两者其一”策略，术后第5周前80%有结果。不过，所有策略均可在术后第7周前产生结果。

图3

讨 论

在本研究中，我们探索了不同采样策略对术后ctDNA分析的影响。我们观察到，在采集时间距离手术较近的样本中，手术创伤对总cfDNA水平有明显影响，这与先前的研究结果一致。此外，术后并发症导致cfDNA水平在初始阶段的升高更为显著。我们的术后配对样本显示，cfDNA的初始升高幅度与之后下降的速率相关。因此，如果不在术后前几周内采集样本，cfDNA分析受术后并发症的影响应该不大。

我们对术后ctDNA预测价值的分析显示，在单时间点分析中，d30在预测预后方面比d14表现稍好，PPV和灵敏度更高，F1评分更高，d30 ctDNA阳性患者（14%）的36个月RFS低于d14阳性患者（28%）。然而，d14检测仍具有很强的预后预测能力，表明如果目标是尽早启动ACT，早期进行ctDNA检测是可行的。这与其他研究观察到的术后2 - 6周进行ctDNA检测具有较高预后预测价值的结果相符。在我们的分析中，发现早期和晚期血液样本之间ctDNA水平上升。这证实了先前的分析结果，即未经治疗的ctDNA阳性患者其ctDNA水平会呈指数增长。先前的研究还表明，ctDNA水平增长较快与预后较差相关。这进一步印证了我们的观察结果，即d14和d30样本之间ctDNA水平升高幅度越大，复发时间越早。然而，尽管后期样本中ctDNA水平似乎确实升高，但在ctDNA检测呈阳性的复发患者中，74%的患者在d14和d30样本中均呈阳性，使得识别复发的灵敏度相当。因此，如果目的是尽早启动ACT，与等待采集后期样本的弊端相比，d14样本可能会产生令人满意的结果。

d30时间点性能略高，这并非因为cfDNA水平降低，这与一些报道称在cfDNA水平高的样本中ctDNA检测存在挑战的研究不同。这种差异可能源于方法学的不同。在本研究中，我们分析了8mL血浆中的所有cfDNA，而先前这些研究中使用的靶向测序方法每个文库的输入上限为66ng。在cfDNA水平显著较高的样本中，限制分析的输入量会导致被分析的DNA分数较小。在ctDNA分数较低的样本中，这可能会增加在文库构建过程中遗漏低频目标的风险。实际上，对我们的数据进行不同输入量上限的模拟分析表明，分析低于100ng的DNA会导致大量的子采样，降低ctDNA检出概率。因此，如果使用有输入上限的检测方法，只能分析部分样本，当受到创伤导致cfDNA水平升高时，d14样本的检测可能会面临较大挑战。

早期血液采样需要考虑的一个因素是分析成本。对于基于测序的ctDNA分析，如果要进行饱和测序，cfDNA水平翻倍会导致测序成本翻倍，从而大幅增加总分析成本。这是常对cfDNA输入量进行限制的原因之一，尤其是在基于测序的分析中。然而，这可能会对检测灵敏度产生不利影响。在对ctDNA指导ACT分配的成本效益分析中，需要权衡增加的分析成本。

一些研究采用的策略是采集多个术后血液样本，并报告任意一个显示ctDNA阳性的样本结果 。最近的DYNAMIC试验探究了ctDNA指导II期结肠癌ACT，该试验在第4周和第7周采集血液样本，并在术后8 - 10周将任意一个样本的阳性结果同时报告给临床医生。其目的是在不影响RFS的情况下减少ACT的使用。在这种治疗降级情况下，尽可能提高灵敏度和阴性预测值（NPV）是理想的，以避免使需要治疗的患者停止治疗。使用“两者其一”策略可提高灵敏度和NPV，但在这次试验中，ACT的启动时间也从对照组的中位8周增加到了ctDNA指导组的12周。或许，最佳的“两者其一”策略是在第2周进行早期ctDNA评估。如果检测到ctDNA，可尽快启动ACT。如果未检测到ctDNA，临床医生可后续再采集血液样本，利用ctDNA水平随时间升高和cfDNA水平随时间降低的特点。

与DYNAMIC试验设计一致，我们观察到，与单样本相比，双样本“两者其一”策略的灵敏度和NPV有小幅提升。然而，考虑到这会使成本翻倍，这种提升是否足以证明多样本策略的合理性，需要根据具体研究进行评估。NPV的差异似乎主要由孤立性肝转移驱动，不过每个复发部位亚组的患者数量较少，这一点需要注意。双样本策略并没有改善肺、腹膜或吻合口（局部）复发的低灵敏度。这些部位之前被描述为ctDNA脱落较少的部位，因此术后ctDNA水平可能很低，即便进行两次采样也很难检测到。

不出所料，我们发现双样本“两者其一”策略的假阳性ctDNA结果较多，这对PPV产生负面影响。在治疗降级的情况下，这可能是可以接受的，但在治疗升级的情况下，可能不是如此。在这方面需要注意的是，术后区分假阳性术后信号可能很困难。因此，我们所称的假阳性实际上可能是真正的生物学信号，这些信号可能自发清除，或者被后续的ACT清除。此外，一些患者可能在我们的随访期之后才出现临床复发。

与治疗降级研究不同，治疗升级研究需要较高的特异性和PPV，以避免基于假阳性结果进行可能有毒性的治疗。在这种情况下，使用第二个样本来确认初始信号可能有益。在我们的分析中，“两者均”策略显示出更高的特异性，因此PPV也明显更好，但代价是灵敏度较低。同样，为避免过度治疗而确认阳性信号的益处需要与增加的成本进行权衡。不过，可以预计术后ctDNA呈阳性的患者数量较少，需要额外样本进行确认的患者数量也不会多。

另一点需要注意的是，ACT在ctDNA阳性患者中的有效性尚未得到确凿证实。因此，术后ctDNA检测虽然在众多研究中已被证明具有较高的预后预测价值，但它可能有其他用途，例如指导强化影像学监测。在这些情况下，术后较晚采样可能不会有问题。

在本研究中，我们使用了肿瘤知情检测方法，这种方法需要事先对肿瘤组织进行分析。在这种情况下，早期ctDNA采样面临的一个挑战是，在组织分析完成之前无法对样本进行检测。因此，对于未来探索ctDNA指导早期ACT启动的研究，使用肿瘤未知检测方法可能更有优势。这将确保样本采集后即可进行分析，更接近我们研究中晚期采集样本的周转时间。

本研究的优势在于纳入了大量术后配对样本。患者是在全国范围内连续招募的，并按照丹麦指南进行治疗。总体而言，611名患者中有101名（17%）接受了ACT，其中大多数为III期患者。在III期患者中，127名患者中有98名（77%）接受了ACT，这一比例与其他欧洲国家相当。未进行ACT的主要排除原因是年龄，根据丹麦指南，80岁以上的患者不接受ACT 。独特的是，我们在术后14天就收集了ctDNA数据，这使我们能够评估早期ctDNA检测在指导ACT分配方面的潜在性能。然而，尽管数据集较大，但复发患者的数量限制了纳入预后分析的患者数量。我们使用了两种不同的ctDNA检测方法。由于术后分析中复发患者数量有限，无法研究cfDNA升高对每种方法的影响。尽管如此，这两种方法在术前样本中的表现相似，提示它们的基线灵敏度相近。此外，我们的部分患者在术后ctDNA分析后接受了ACT，这可能会干扰这些ctDNA分析的预后准确性。然而，由于本研究的重点是比较d14和d30这两个采样时间点，且这两个时间点均在ACT开始之前，所以这一限制对两个时间点的影响相同，不影响整体结论。最后，本研究队列复发预测的灵敏度低于37%。由于我们的“晚期”样本d30也比大多数其他研究的样本采集时间都早，因此很难与其他检测进行比较。ctDNA检测的灵敏度是否足够有临床效用，还需要进一步研究比较ctDNA指导的ACT分配和标准ACT分配。

总之，虽然对术后30天采集的样本进行ctDNA分析更为可靠，但即使是术后14天采集的样本也具有很高的预后预测潜力。d14和d30检测性能的细微差异，可能是因为后期时间点ctDNA水平升高，更有利于检测。双样本检测策略可能在第一个样本中就能获得一些早期ctDNA结果，而增加第二个（较晚）时间点能够提高检测的灵敏度。在特定的临床环境中，这种优势是否超过双样本策略增加的成本，需要进一步评估。

参考文献：

Henriksen TV, Demuth C, Frydendahl A, Nors J, Nesic M, Rasmussen MH, Larsen OH, Jaensch C, Løve US, Andersen PV, Kolbro T, Thorlacius-Ussing O, Monti A, Kildsig J, Bondeven P, Schlesinger NH, Iversen LH, Gotschalck KA, Andersen CL. Timing of circulating tumor DNA analysis aimed at guiding adjuvant treatment in colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2025 Feb 20. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-24-3200. Epub ahead of print. PMID: 39976513.

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