快速、可靠的细菌检测和鉴定对于临床诊断、个性化用药和预防治疗耐药性至关重要。传统的基于培养的方法既耗时又费力，且无法检测未知和难以培养的细菌物种。近年来，基质辅助激光解吸/电离-质谱法（MALDI-MS）已迅速应用于临床实践，基于独特的蛋白质谱来鉴定细菌，但与传统方法一样存在耗时的分离步骤。

近日，杂志Nature Communications上发表了一篇题为“Universal, untargeted detection of bacteria in tissues using metabolomics workflows”的文章。作者描述了一种基于生物标志物的策略，利用细菌小分子代谢物和脂质，使用质谱（MS）直接检测复杂样品中的细菌。作者确定了359个分类群特异性标记（TSMs），并将其应用于健康和癌变胃肠道组织以及粪便样本的细菌原位检测。作者证明了该工作流程在使用标准的基于质谱的分析方法检测细菌具有普遍适用性。

图片来源：Nature Communications

主要内容

分类群特异性标记的可行性

细菌图谱包含233种不同细菌的3274个菌株，隶属于机会致病菌和共生菌的5门、11纲、23目、47科、81属。包含所有233种细菌代谢物的整个训练数据集中共检测到5866个独特的m/z值，其中359个特征在一定的系统发育水平上是特异性的（下图c），并被认为是分类群特异性标记（TSMs）。

在门级、纲级、目级、科级、属级和种级分别检测到6、70、25、113、29和116个TSM。大多数这些标记都是在拟杆菌门的成员中发现的（下图c），这表明该细菌门的代谢明显不同。在属水平上发现了29个TSMs，分别来自放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。在物种水平上发现的TSM数量最多，有116个标记来自34个细菌物种（下图d）。这相当于符合检测条件的细菌种类的36%。

分类群特异性标记概述。图片来源：Nature Communications

TSMs定量细菌的能力

在种水平上发现了8个艰难梭菌的TSMs。结果发现艰难梭菌物种水平的TSMs丰度在不同的培养基中有所不同（图b）。对同一分类单元的不同类群内的标记丰度研究发现，虽然TSM表达可能在单一细菌物种中保守，但这些水平在相同系统发育水平的不同成员之间经常丰度差异很大。例如m/z 640.537在Flavobacteria所有成员中表达，但不同物种之间的丰度差异很大（图e）。这突出了使用基于测序的分析进行平行确认，以便进一步收紧TSM选择的标准的重要性。

TSM定量能力的评估。图片来源：Nature Communications

在细菌培养物上生物标记物的验证

作者使用了“内部”和“外部”两个数据集测试TSM是否可用于鉴定纯细菌培养物。使用与训练数据库相同的方法，从所有文件中提取359个变量的峰值强度。在内部数据集中，确定了263个变量的AUC，而对于外部数据集，确定了134个变量的AUC。内部和外部数据集变量的中位AUC值分别为0.997和0.985（如下图）。结果表明，TSM特征中的许多都是高度特异性的。

使用两个验证数据集验证TSM。

图片来源：Nature Communications

在复杂样本中直接检测TSM

为了证明TSMs在复杂生物样品中检测细菌的适用性，作者尝试检测不同组织中细菌的存在和分布。幽门螺旋杆菌感染后1周的小鼠胃组织中，标记物m/z 299.260 （Helicobacteriaceae科）具有明显的热点模式；16S rRNA FISH分析显示在相同的位置细菌存在热点（下图a-d）。这些细菌很可能确实起源于幽门螺旋杆菌。

在小鼠结直肠癌组织中，可观察到一些属于拟杆菌门类的标记物，它们是丰富的肠道微生物。TSMs和16S rRNA FISH成像揭示了类似的微生物定位热点的模式（图e,f）。FISH和TSMs之间标记强度的差异可能与实际的局部细菌组成以及不同标记之间的电离反应差异有关。

在复杂样本中直接检测TSM。

图片来源：Nature Communications

总结与讨论

作者编制了基于小代谢物的质谱分析技术的最全面的细菌小代谢物谱数据库。数据库的物种覆盖率仍然很低，只有233种，主要是机会致病性物种。高系统发育水平的标记（如门）主要用于拟杆菌门，标记的表达在该水平上的不同成员之间存在差异；较低系统发育水平的标记可用于更广泛的细菌群，但丰度也受到不同培养条件的影响。作者确定了359个分类群特异性标记（TSMs），并将其应用于健康和癌变胃肠道组织以及粪便样本的细菌原位检测。作者证明了该工作流程在使用标准的基于质谱的分析方法检测细菌具有普遍适用性。为了进一步促进这些标志物的临床转化，鉴定每个标志物的分子ID是未来TSM验证的关键步骤。

综上所述，TSMs可作为生物流体中细菌快速检测的有用工具，用于一级筛选应用。未来的研究需要在不同的生物学和临床情况下仔细验证这些标记物。

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