引言

近年来，基因编辑技术在免疫治疗和细胞治疗领域取得了飞跃性进展，尤其是在T细胞工程化改造（T cell engineering）方面。T细胞的基因编辑对于CAR-T疗法、异基因T细胞治疗（Allogeneic T cell therapy）以及其他细胞免疫疗法至关重要。然而，传统T细胞编辑方法面临效率低、异质性高以及筛选困难等问题，严重限制了基因编辑T细胞的广泛应用。

2月5日Nature Biotechnology的研究报道“SEED-Selection enables high-efficiency enrichment of primary T cells edited at multiple loci”，研究人员开发了一种创新的T细胞筛选方法——SEED-Selection（Synthetic Exon Expression Disruptor Selection）。这一技术通过合成外显子表达破坏因子（SEEDs），结合负向筛选策略，能够高效富集多基因编辑的T细胞，大幅提高基因编辑纯度，使T细胞基因工程技术迈向更精准、更可控的阶段。

T细胞基因编辑的挑战

T细胞基因编辑在肿瘤免疫治疗和自身免疫病治疗中具有重要应用，但目前的编辑方法仍然面临以下挑战：

编辑效率低

CRISPR-Cas9等基因编辑工具虽然可以高效诱导T细胞基因突变，但由于同源重组修复（HDR）效率较低，敲入目标基因（如CAR受体）的成功率有限。尤其是在多基因同时编辑时，T细胞通常会表现出低效的基因整合能力。

产物异质性高

传统的CRISPR-Cas9基因编辑方式会产生大量部分编辑的T细胞。这些细胞在治疗过程中可能表现出不均一的功能活性，影响临床疗效。例如，部分未完全敲除TCR（T细胞受体）或B2M（β2微球蛋白）的T细胞仍可能引起免疫排斥反应或降低治疗效果。

纯度不足

目前T细胞基因编辑的一个核心问题是如何高效富集那些完全被编辑的T细胞，同时去除未成功编辑的细胞。由于现有筛选技术（如FACS或磁珠分选）难以精准区分成功编辑与部分编辑的T细胞，导致最终的细胞治疗产品仍包含大量杂合编辑的细胞。

为了解决这些挑战，研究人员开发了SEED-Selection技术，以更精准、高效的方式筛选完全编辑的T细胞。

SEED-Selection的原理

SEED-Selection技术的核心思想是在基因编辑的同时，破坏一个内源性表面蛋白的表达，并利用这一表面蛋白的缺失进行负向筛选，以富集完全编辑的T细胞。

目标基因敲入与表面蛋白破坏

研究人员设计了一种特殊的修复模板（homology-directed repair template, HDRT），使其在目标基因敲入（knock-in, KI）的同时，破坏一个内源性表面蛋白的表达。最常被破坏的表面蛋白包括：

T细胞受体（TCR）：TCR是T细胞特异性识别抗原的关键分子，去除TCR可降低异基因T细胞的免疫排斥反应。

β2微球蛋白（B2M）：B2M是MHC-I复合物的组成部分，其缺失可阻止T细胞被宿主免疫系统识别。

当目标基因成功敲入后，这些表面蛋白会失去表达，从而可以利用免疫磁珠（immunomagnetic selection）或流式细胞分选（FACS）去除未被完全编辑的细胞，仅保留那些成功敲入目标基因的T细胞。

负向筛选提高T细胞纯度

研究人员利用免疫磁珠技术，以TCR或B2M的表达缺失为标记，去除所有未完全编辑的T细胞。例如：

若在TRAC基因（TCR-α恒定区）上插入CAR基因，同时破坏TCR的表达，则所有TCR⁺的细胞可通过磁珠去除，仅保留TCR⁻CAR⁺的完全编辑T细胞。

若在B2M位点敲入CD47基因，同时破坏B2M的表达，则B2M⁺的细胞可被去除，最终获得B2M⁻CD47⁺的高纯度T细胞。

适用于多基因编辑

SEED-Selection的优势在于它可以同时编辑多个基因位点。例如，在同一批T细胞中：可在TRAC位点敲入CAR，同时破坏TCR。可在B2M位点敲入CD47，同时破坏B2M。

通过两步负向筛选（去除TCR⁺和B2M⁺的细胞），最终可获得高纯度的TCR⁻CAR⁺B2M⁻CD47⁺T细胞。

SEED-Selection的实验数据

研究人员通过一系列实验验证了SEED-Selection的有效性，并用多个基因编辑策略对比评估其筛选效果。

单基因敲入的富集效果

实验数据显示，在TRAC位点敲入CAR，并通过TCR⁻筛选后，最终获得92.6%纯度的TCR⁻CAR⁺T细胞。在B2M位点敲入CD47，并通过B2M⁻筛选后，获得98%纯度的B2M⁻CD47⁺T细胞。

多基因座同时编辑的高效筛选

在TRAC和B2M两个基因位点同时敲入外源基因后，双重负向筛选可获得89.4%纯度的TCR⁻CAR⁺B2M⁻CD47⁺T细胞，远超传统筛选方法的效率。

NHEJ抑制剂的优化

实验还发现，结合非同源末端连接（NHEJ）抑制剂可进一步提高基因敲入效率：在高感染复数（MOI = 3×10⁵）下，结合NHEJ抑制剂M3814，可获得83%的双等位基因敲入。即便在较低MOI（MOI = 1×10⁴）下，也能检测到一定比例的双等位基因敲入。

SEED-Selection的临床应用

SEED-Selection技术的突破性使其在肿瘤免疫治疗、异基因T细胞治疗和细胞工程化改造等领域具有广阔的临床应用前景。

提高CAR-T疗法的有效性

通过SEED-Selection，可获得更高纯度的TCR⁻CAR⁺T细胞，减少未完全编辑细胞带来的不良影响，提高疗效。有助于开发通用型CAR-T（universal CAR-T），使细胞疗法更易推广。

增强异基因T细胞的免疫耐受性

通过TCR敲除降低移植物抗宿主病（GVHD）。通过B2M敲除减少宿主免疫系统对异基因T细胞的排斥。

应用于多功能T细胞治疗

结合CD47敲入技术，使T细胞能够躲避免疫系统清除，提高存活率。通过多基因编辑优化T细胞的耐受性，使其在不同治疗环境下均能稳定发挥作用。

SEED-Selection技术为T细胞基因编辑带来了新的突破。通过高效负向筛选策略，该技术在多个实验中实现了高达98%的基因编辑纯度，显著提高了T细胞治疗的可行性和标准化程度。未来，该技术有望成为细胞治疗领域的标准方法，为癌症免疫治疗和基因治疗带来更多可能性。

参考文献

Chang CR, Vykunta VS, Lee JHJ, Li K, Kochendoerfer C, Muldoon JJ, Wang CH, Mazumder T, Sun Y, Goodman DB, Nyberg WA, Liu C, Allain V, Rothrock A, Ye CJ, Marson A, Shy BR, Eyquem J. SEED-Selection enables high-efficiency enrichment of primary T cells edited at multiple loci. Nat Biotechnol. 2025 Feb 5. doi: 10.1038/s41587-024-02531-6. Epub ahead of print. PMID: 39910194.

Tags： Nature Biotechnology：细胞治疗新突破：SEED-Selection带来更高效的T细胞筛选