在过去的2000多年中，枸杞作为中药材的一种，被广泛应用于茶饮、果汁、酒类、保健品及固态食品等多种产品之中。枸杞中主要的生物活性成分为枸杞多糖（LBPs），研究证实其具备预防及治疗糖尿病、癌症、高脂血症、增强免疫能力及缓解肾炎并发症等多种功效。尽管如此，关于枸杞成熟过程中的代谢动力学，当前的认识仍显不足。

近期，发表于《Postharvest Biology and Technology》期刊的研究论文“Multi-omics integration analysis reveals metabolic regulation of carbohydrate and secondary metabolites during goji berry (Lycium barbarum L.) maturation”，通过整合三个不同成熟阶段的理化指标、代谢组学、转录组学及蛋白质组学数据，揭示了枸杞（Lycium barbarum L.）成熟过程中碳水化合物及次生代谢产物的代谢调控机制。

图1 论文首页

枸杞果实成熟过程中糖和次生代谢产物的动态变化

在枸杞果实成熟过程中，糖分、总蛋白、甜菜碱及类黄酮含量均呈现显著变化。具体而言，多糖含量在YF阶段达到最高值，而在GF与RF阶段则持续下降（P<0.05）（图2A）。半乳糖、果糖及总糖含量在GF阶段显著上升（P<0.05），并在RF阶段达到最高值（图2B、C及E）。蔗糖含量在GF阶段最高，至RF阶段显著减少（P<0.05）（图2D）。总蛋白含量在三个发育阶段中保持相对稳定（图2F）。甜菜碱含量在GF阶段达到峰值，而在RF阶段显著降低（P<0.05）（图2G）。黄酮含量在YF与GF阶段无显著差异，但在RF阶段降至最低（图2H）。

图2 枸杞YF（幼果）、GF（青果）、RF（红果）成熟阶段的生理指标

代谢组学、蛋白质组学、转录组学特征

非靶向代谢组学研究揭示了枸杞果实成熟不同阶段代谢物的变化特征。通过质量控制(QC)样品的检验，确保了实验数据的可靠性。总离子色谱(TIC)曲线与主成分分析(PCA)图谱的高度一致性，表明了数据的质量。采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)方法，鉴定并验证了差异代谢物(DEM)，共识别出1097种代谢物。其中，氨基酸、肽及其类似物占比最高（57.6%），其次是碳水化合物及其衍生物（42.5%）（图3A）。PCA图谱显示，各成熟阶段的五个生物学重复样本聚类紧密，进一步验证了数据的可靠性（图3B）。根据代谢组学分析结果，共鉴定出129种DEM，其中红色果实阶段(RF)的数量最多（图3C、D）。

此外，代谢组学、蛋白质组学和转录组学的综合分析结果显示，RF阶段的DEM、差异表达蛋白(DEP)和差异表达基因(DEG)显著富集，表明该阶段的代谢变化与红色果实阶段的显著相关性。

图3 枸杞果实 YF、GF 和 RF 阶段的代谢组学分析

多组学共表达网络

研究进一步对蓝色和红色模块内的DEM、DEP及DEG之间的关系进行了深入分析，揭示了DEG-hub与DEP-hub之间的关联网络。在蓝色模块中，基因枸杞的蔗糖磷酸合酶（LbSPS）与7个DEM及53个DEP表现出显著相关性，特别是与D-葡萄糖的相关性（图4A）。在红色模块中，蛋白质枸杞跨膜emp24结构域（LbTMED）与8个DEM及31个DEG存在相关性（图4B）。在绿色和青绿色模块中，基因枸杞葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶（LbGLGC）与枸杞果糖-1,6-双磷酸酶（LbFBP）分别与64种和49种DEG表现出相关性（图4C、D）。

图4 共表达相互作用网络

果实成熟过程中糖和次生代谢物生物合成的调控网络

研究采用了MapMAN通路分析方法对差异表达基因（DEG）进行了生物过程分析，揭示了其在碳水化合物代谢、细胞壁结构、脂质代谢、次生代谢以及氨基酸代谢等多个生物过程中的参与情况（图5A）。在碳水化合物代谢过程中，枸杞葡萄糖-6-磷酸-1-表异构酶（LbGLP）催化D-葡萄糖转化为D-葡萄糖-6P，以应对D-葡萄糖的积累。上调的基因LbGLGC和枸杞颗粒结合淀粉合酶（LbWAXY）促进了D-葡萄糖-1P向直链淀粉和蔗糖的转化，通过双分子荧光互补（BiFC）实验验证了预测的蛋白质-蛋白质相互作用（图5B）。LbSPS基因的下调影响了蔗糖的代谢过程，包括其通过枸杞β-呋喃果糖苷酶（LbINV）转化为D-葡萄糖，以及枸杞棉子糖合酶（LbRS）催化下形成棉子糖，进而转化为半乳糖和果糖，导致果糖和半乳糖的积累增加，多糖含量减少（图5B）。此外，LbFBP基因将D-果糖-6P转化为D-果糖-1,6-P2，参与了次级代谢和氨基酸代谢过程。

在次级代谢过程中，枸杞中的黄烷酮3-双加氧酶（LbF3D）和甜菜碱醛脱氢酶（LbBADH）活性降低，从而抑制了黄酮类化合物和甜菜碱的合成（图5B）。此外，甜菜碱的代谢途径亦影响枸杞甘氨酸羟甲基转移酶（LbGLYA）对甘氨酸的合成，进而影响氨基酸代谢过程中丝氨酸的生成。研究在氨基酸代谢途径中观察到L-苏氨酸、丝氨酸和胆碱的显著积累（图5B）。

多组学分析显示，枸杞果实成熟期间，D-葡萄糖作为关键代谢物大量积累，此积累过程受到一系列基因和酶的调控。LbSPS基因的下调导致蔗糖含量降低。而LbGLP、LbGLGC、LbWAXY、LbINV、LbFBP和LbRS等基因的上调，则促进了多糖、半乳糖、果糖及总糖的积累。LbF3D和LbBADH的下调导致类黄酮和甜菜碱的积累减少。LbGLYA基因的上调则促进了代谢物中氨基酸含量的增加。

图5 代谢途径中关键 DEM、DEP 和 DEG 的调节

枸杞LbNAC 转录因子与 LbSPS 启动子结合并调节表达

该研究将pGADT7-LbNAC猎物载体与pHis2-ProLbSPS诱饵载体共转化至酵母菌株Y187中，并将共转化的酵母细胞培养在DDO和TDO/3-AT平板上（图6）。结果显示，共转化pHis2-ProLbSPS+pGADT7-LbNAC的酵母细胞在含有50 mM 3-AT的平板上能够生长，而共转化pHis2-ProLbSPS+pGADT7的酵母细胞则受到显著抑制，表明LbNAC蛋白能够直接与LbSPS启动子结合。

为进一步证实该相互作用，研究还进行了effector-reporter实验。结果显示，共转化pGreenⅡ0800-ProLbSPS-LUC与pGreenⅡ62-SK-35S-LbNAC的烟草叶片中，荧光信号强度高于对照组pGreenⅡ0800-ProLbSPS-LUC与pGreenⅡ 62-SK-35S，且LUC/REN比值也显著高于对照组（图6）。表明LbNAC通过直接结合启动子区域，激活了LbSPS基因的表达。

图6 LbNAC与LbSPS启动子结合

结论

通过对枸杞果实成熟及其采后阶段的代谢特性进行全面分析，该研究揭示了关键的分子参与者和相关代谢途径。同时，所识别的候选基因有望应用于枸杞营养品质提升及采后特性改善的育种工作中。

参考文献：

Yaping Ma , Mura Jyostna Devi , Lihua Song, Handong Gao , Lei Jin, Bing Cao.Multi-omics integration analysis reveals metabolic regulation of carbohydrate and secondary metabolites during goji berry (Lyciumarbarum L.) maturation.Postharvest Biology and Technology 218 (2024) 113184

Tags： 宁夏大学：枸杞成熟背后的碳水化合物与次生代谢物调控大揭秘！