心肌细胞线粒体功能障碍是导致心衰的关键病理机制，但临床上缺乏能够有效恢复心肌细胞线粒体功能的治疗措施。线粒体是唯一含有自身基因组(即mtDNA)的真核细胞器。mtDNA转录会产生电子传递链组装所必需的蛋白组分，与细胞核基因组转录协同控制着线粒体稳态和细胞能量代谢。越来越多的证据表明，mtDNA会发生甲基化等表观遗传修饰，这些表观遗传修饰通过影响mtDNA转录、复制等过程实现对线粒体功能和细胞能量代谢的精准调控。然而，线粒体基因组表观遗传修饰在调节心肌细胞线粒体稳态及在心脏疾病中的病理生理意义还不清楚。

2024年4月30日，空军军医大学西京医院陶凌、张富洋团队在Circulation上发表了题为“Rectifying METTL4-Mediated N6-Methyladenine Excess in Mitochondrial DNA Alleviates Heart Failure (纠正METTL4介导的线粒体DNA过度6-甲基腺嘌呤甲基化减轻心力衰竭)”的研究论文，揭示了6-甲基腺嘌呤(6mA)这一线粒体基因组表观遗传修饰在调节心肌细胞线粒体功能和心衰等心脏疾病中未被充分认识的关键作用。

首先，研究者利用超高效液相色谱串联质谱系统(UHPLC-QQQ-MS)和斑点印记法(Dot blot)检测了分别由血管紧张素II/苯肾上腺素(AngII/PE)持续泵注和慢性缺血再灌注损伤导致的非缺血性和缺血性心力衰竭小鼠心肌细胞mtDNA的5-甲基胞嘧啶(5mC)和6mA甲基化丰度变化。无论在非缺血性还是缺血性心衰小鼠心肌细胞中，mtDNA的6mA丰度显著增加，而5mC丰度无明显变化。随着小鼠出生后生理性成熟过程中，心肌细胞mtDNA的6mA丰度显著降低，而在心衰时其丰度重新显著增加。研究者进一步发现，哺乳动物6mA甲基转移酶METTL4主要定位于心肌细胞线粒体。成年心衰患者和小鼠心肌细胞METTL4表达和mtDNA 6mA水平均显著增加。这些结果表明，由METTL4催化的mtDNA 6mA丰度增加是衰竭成年心肌细胞线粒体基因组重新趋向于幼稚样状态的线粒体表观遗传学改变(图1)。

图1. 由METTL4催化的mtDNA 6mA丰度增加是衰竭成年心肌细胞重新趋向于幼稚样状态的线粒体基因组表观遗传学改变

研究者进一步发现，无需给予任何的病理刺激，腺相关病毒介导的心肌细胞特异性METTL4过表达可诱导成年小鼠自发地出现心肌细胞线粒体功能障碍和心衰表型。结合染色质免疫共沉淀(ChIP)和6mA特异性DNA甲基化免疫共沉淀测序(MeDIP-Seq)分析发现，METTL4蛋白可以与mtDNA启动子区域结合，并依赖其6mA甲基转移酶活性催化mtDNA启动子序列发生6mA修饰，抑制TFAM和POLRMT等线粒体转录起始复合体在mtDNA启动子区域的组装，从而导致心肌细胞mtDNA转录阻滞和线粒体功能障碍(图2)。

图2. METTL4催化mtDNA启动子区域6mA修饰并破坏线粒体转录起始复合体组装，造成心肌细胞mtDNA转录阻滞和线粒体功能障碍

为探索心衰病理刺激导致心肌细胞METTL4转录表达上调的机制，利用转录因子预测及细胞实验，研究者首次鉴定出p53是成年心肌细胞中响应损伤因素从而重新启动Mettl4基因转录表达并随之导致mtDNA 6mA丰度增加的关键转录因子。这些结果揭示了一个由p53作为核心转录因子的、响应损伤因素活化的mtDNA 6mA修饰关键调控机制(图3)。

图3. 在心衰病理因素作用下，p53调节成年心肌细胞Mettl4基因转录

为了进一步明确METTL4及其催化的mtDNA过度6mA修饰能否作为心衰的防治靶点，研究者首次构建了由他莫昔芬诱导的成年心肌细胞特异性Mettl4敲除(Mettl4 cKO)小鼠。结果显示，成年心肌细胞特异性敲除METTL4表达显著抑制AngII/PE泵注导致的mtDNA过度6mA甲基化，减轻线粒体功能障碍并改善心脏功能和病理性重构(图4)。另外，即使小鼠已经罹患由AngII/PE泵注导致的非缺血性心衰或由缺血再灌注导致的缺血性心衰，利用腺相关病毒向心肌细胞特异性递送METTL4 shRNA仍可有效地减轻心肌细胞线粒体功能障碍并改善心衰症状。

图4. 成年心肌细胞特异性敲除Mettl4基因改善了AngII/PE持续泵注导致的心脏线粒体功能障碍和心衰

综上，这一工作首次揭示了由METTL4催化的6mA甲基化是一种调控心肌细胞mtDNA转录和线粒体功能稳态的关键线粒体基因组表观遗传学修饰类型。在心衰病理刺激作用下，p53-METTL4-mtDNA 6mA轴的过度活化导致心肌细胞mtDNA转录阻滞和线粒体功能障碍，进而驱动心衰发生发展(图5)。纠正mtDNA过度6mA甲基化等线粒体基因组表观遗传修饰异常是恢复心肌细胞线粒体功能和治疗心衰的全新思路。

图5. 机制说明图

上述工作主要由空军军医大学西京医院心血管内科的张富洋副主任医师、张玲助理研究员、胡洸瑜讲师等人共同完成，空军军医大学西京医院心血管内科的陶凌教授和张富洋副主任医师为文章共同通讯作者。上述工作得到了国家自然科学基金委员会和陕西省自然科学基础研究计划的经费资助。

原文链接：

https://www.ahajournals.org/doi/abs/10.1161/CIRCULATIONAHA.123.068358

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