在过去的几十年中，开发了针对非小细胞肺癌（NSCLC）脑转移（BM）的放疗（RT）。然而，缺乏治疗反应预测性生物标志物限制了NSCLC-BM的精准治疗。为了寻找RT预测性生物标志物，本研究探索了NSCLC-BM患者中RT对脑脊液（CSF）游离DNA（cfDNA）的影响以及T细胞亚群比例。共纳入 19 例诊断为 NSCLC-BM 的患者。在RT前、RT期间和RT后收集 19 例患者的CSF和 11 例患者的匹配血浆样本。提取CSF和血浆中的cfDNA，通过二代测序（NGS）计算CSF肿瘤突变负荷（cTMB）。使用流式细胞术分析外周血T细胞亚群比例。在有匹配样本的患者中，CSF cfDNA检出率高于血浆cfDNA。RT后CSF cfDNA突变丰度降低。RT前后cTMB没有显著差异。cTMB 降低或检测不到的患者的中位颅内无进展生存期（iPFS）未达到，这些患者的iPFS趋向于长于cTMB稳定或增加的患者（HR 0.28，95% CI 0.07–1.18，P = 0.067）。RT后外周血CD4⁺ T细胞比例降低。本研究表明，cTMB或可作为NSCLC-BM患者的预后生物标志物。

研究背景

脑转移（BM）在晚期非小细胞肺癌（NSCLC）常见且致命。约10%的BM发生于新诊断的NSCLC患者，25%-40%发生于根治性治疗后。尽管靶向治疗、免疫治疗和放疗（RT）在过去十年中取得了快速进展，但NSCLC-BM的临床结局和生活质量相对较差。NSCLC-BM患者缺乏循证管理。最近，随着对癌症驱动基因的深入研究和新型靶向疗法的出现，一些靶向药物可以穿过血脑屏障，在一段时间内预防或控制脑转移。然而，治疗疗效仅限于无症状或稳定BM，部分患者最终会出现中枢神经系统进展。

RT是NSCLC BM的标准治疗方法。对于具有驱动基因突变的患者，靶向治疗联合RT可能对这些患者有效。然而，既往发表的回顾性临床研究的结论并不一致。目前，治疗疗效的评估主要基于影像学，不能立即反映治疗效果，也不能反映RT对BM分子克隆的影响，无法指导临床医生设计个体化治疗方案。因此，迫切需要可以预测联合治疗疗效的生物标志物。

免疫检查点抑制剂（ICI）可以恢复免疫细胞的活力，对于无驱动基因突变或对多种靶向疗法耐药的患者，ICI是另一种有前途的治疗方法。研究显示，ICI联合RT可相互增强NSCLC BM治疗疗效。然而，尚不清楚RT是否会诱导和刺激NSCLC BM患者的免疫系统。

最近有研究报道，脑脊液（CSF）游离DNA（cfDNA）基因突变检出率高于血浆cfDNA，可以及时反映治疗疗效。此外，基于覆盖>1 Mb基因组区域的NGS大panel，可以准确计算肿瘤突变负荷（TMB）。本研究探索了NSCLC-BM患者RT期间CSF cfDNA的动态变化和外周血T细胞亚群的频率。我们首次发现NSCLC-BM患者RT前后CSF肿瘤突变负荷（cTMB）的变化可预测颅内无进展生存期（iPFS）。

研究结果

患者特征

纳入了19例2018年3月至2020年1月期间在南方医科大学或广东三九脑科医院诊断为NSCLC BM的患者。在RT前、RT期间和RT后收集 19 例患者的CSF和 11 例患者的匹配血浆样本。基线人口统计学和临床特征见表1。5例患者（D06、D07、S01、S03、S08）经CSF细胞学检查诊断为软脑膜转移。3例患者（S02、S05、S07）通过神经系统症状和钆增强MRI发现软脑膜转移。值得注意的是，4例患者（D01、D04、D07、S11）在RT期间未接受任何同步系统治疗。

表1

RT对NSCLC-BM患者CSF cfDNA的影响

比较了RT前、RT期间和RT后CSF cfDNA水平。RT后，D07 CSF cfDNA量明显增加，D06和S01 CSF cfDNA量减少，其他患者RT后CSF cfDNA量无明显变化（图1）。队列中，RT期间和RT结束时CSF cfDNA检出率略低于RT前。正如预期的那样，在验证队列中，CSF cfDNA检出率高于血浆 cfDNA（图2A）。除D06外，大多数患者RT前后变异类型的组成相似，许多拷贝数变异发生于RT结束时。RT后CSF突变丰度较RT前显著增加（图2B）。

图1

图2

13例患者（D01、D03、D04、D07、D08、S01、S02、S03、S05、S06、S07、S10、S11）CSF突变丰度最初增加，随后RT期间下降，突变数量稳定或减少（图3）。相反，D06、S04、S08在RT后CSF突变丰度和突变数量明显增加。7例患者（D03、D06、D07、S03、S04、S06、S08）在RT结束时检测到新的突变。D03、S03和S04检测到的新突变在配对的肿瘤组织或血浆样本中也检测到。此外，D02、D05和S09在RT前、RT期间或RT后CSF均未检测到突变。

图3

比较系统治疗进展后新出现BM的患者（2/5）或初诊时伴有BM患者（2/6），既往研究中报告的罕见或耐药突变在系统治疗后新出现BM的患者中较常见（6/7）。在RT期间，这些突变的数量和丰度有所下降。

RT前后CSF TMB（cTMB）没有显著差异（图4A）。cTMB降低或检测不到的患者中位颅内无进展生存期（iPFS）未达到，这些患者的iPFS趋向于长于cTMB稳定或增加的患者（中位：4.43个月，范围：0.23-8.63个月）（HR 0.28，95% CI 0.07-1.18，P = 0.067）（图4B）。

图4

iPFS的危险因素

为了确定预测接受RT±EGFR-TKI治疗的BM患者iPFS的独立危险因素，我们进一步基于脑转移诊断类型、软脑膜受累、体能状态（PS）评分、分级预后评估（GPA）评分和RT结束时新突变检出情况进行了亚组分析。没有发现显著的独立危险因素，可能是由于样本量有限和随访时间短。在本研究中，初始 EGFR-TKI±化疗后 BM进展的患者（6.47个月）的中位 iPFS 往往短于初诊时伴有 BM 的患者（未达到）和系统治疗（有或无TKI）后新出现 BM 的患者（9.13个月）。原因可能为初始EGFR-TKI±化疗后BM进展的患者很多生存结局非常糟糕，或者非挽救性RT可能使 BM患者获益。确切的原因值得进一步探索。

BM RT对血液免疫指标的影响

与之前的结果一致，RT前后血浆TMB无显著差异（图4C）。此外，分析外周血中T细胞亚群的变化，观察到RT后CD4⁺幼稚T细胞比例显著降低。RT期间，总T细胞、自然杀伤（NK）细胞和B细胞比例的变化在统计学上不显著，但总T细胞和B细胞的比例呈上升趋势。调节性T（Treg）细胞，一种抑制性T细胞，没有显著变化。我们没有发现其他T细胞亚群的比例发生显著变化，包括记忆T细胞（CD4⁺CD45RO⁺），细胞毒性T细胞（CD3⁺CD8⁺），辅助性T细胞（CD3⁺CD4⁺），CD8⁺ CD28⁺ T细胞和CD8⁺ CD28^- T细胞。

讨 论

BM 对大多数临床医生来说是一个挑战，全脑放疗（WBRT）是公认的标准方法，对这些患者有效。尽管一些关于靶向治疗的研究对RT用于驱动基因突变BM患者提出了挑战，目前仍缺乏头对头临床试验比较单独靶向治疗与靶向治疗联合RT的疗效。因此，靶向治疗与RT联合治疗BM仍然存在争议，引起临床的强烈关注。NSCLC BM单独RT或联合治疗的疗效评估除影像学外，仍然有限。NGS的发展提供了一种新的方法，可以通过分析CSF评估治疗效果。

2020年美国临床肿瘤学会（ASCO）年会上公布的一项研究显示，从开始RT（胸：2.5-4.0 Gy/F；脑：6-9 Gy/F）到ctDNA量达到峰值的中位时间为2日（IQR：1-3日）。在血浆中，ctDNA只占cfDNA的一小部分，因为大多数cfDNA来源于非肿瘤细胞，尤其是血细胞。与血浆cfDNA相比，CSF cfDNA大多来源于肿瘤裂解。在RT期间和RT后，肿瘤细胞破坏导致细胞内内容物（包括cfDNA）的释放。在本研究中，只有 5.3%（1/19）的患者 CSF cfDNA 量显著增加，10.5%（2/19）的患者显著减少。RT期间（开始后 10-14 天）和/或RT结束时（开始后 26-28 天）相比RT前，未发现 CSF cfDNA 的动态变化。CSF cfDNA 新突变检出率与先前研究报告的一致，在本研究中，21%（4/19）的患者治疗后 CSF cfDNA 检测到新突变。值得注意的是，3 例患者（D03、S03、S04）RT结束时检测到的新突变在相应的肺肿瘤或血浆样本中也检测到。研究表明，放疗诱导的肿瘤溶解可能增加CSF cfDNA检出率。

据报道，EGFR-TKI获得性耐药机制包括EGFR T790M突变、MET或ERBB2扩增，EGFR-TKI进展时间较短与ERBB2、MET和TP53突变相关。此外，肺癌中CDKN2A缺失和EGFR突变共存通常提示对EGFR-TKI治疗反应较差。对EGFR-TKI耐药的亚克隆可能起源于多种基因变异，包括肿瘤干细胞中TP53突变、CDKN2A缺失和RB1缺失。Kenji Sugio报道，PTEN缺失可能导致罕见EGFR G719X突变患者EGFR-TKI获得性耐药。研究发现，在NSCLC患者中，MDM2扩增可诱导EGFR-TKI原发性耐药，并预测不良预后。CDC73、SMAD4、RB1和PIK3CA也可能在EGFR-TKI原发性耐药中发挥重要作用。此外，Keunchil Park发现，在初始EGFR-TKI失败后接受第三代TKI的患者中，TP53、RB1、PTEN和MDM2基因变异也与PFS较差独立相关。在本研究中， 52.63%（10/19）的患者检测到与 EGFR-TKI 获得性或原发性耐药相关的突变。除S08外，其他患者EGFR-TKI耐药相关突变的丰度或数量在RT期间均有不同程度的降低。值得注意的是，这些患者中有 70%（7/10）iPFS较长（> 110 天），这提示单独RT或 EGFR-TKI 联合 RT 可能有效减少或消除 NSCLC BM 中 EGFR-TKI 耐药克隆。

本研究使用了大panel（> 300 个基因），还计算了CSF肿瘤突变负荷（cTMB）并探索了其在 BM 患者中的临床价值。值得注意的是，cTMB 降低或检测不到的患者的中位 iPFS 长于cTMB稳定或增加的患者。然而，这一发现需要通过多中心、大队列研究得到验证。cTMB是否可以像血液TMB一样作为预后生物标志物，这在很大程度上仍然未知，需要进一步研究。此外，本研究还初步探索了BM RT是否会刺激免疫系统反应。基于对血液和血浆TMB淋巴细胞亚群的分析，我们发现BM RT对免疫系统的影响不确定。

在晚期NSCLC BM患者中，RT与治疗获益相关。CSF cfDNA基因突变检出率高于血浆cfDNA，可能是更有价值的RT疗效预测标志物。RT前后血浆TMB无显著差异，RT后CD4+幼稚T细胞比例显著降低。综上所述，这些结果表明，放疗诱导的肿瘤溶解可能提高CSF cfDNA检出率。单独RT或EGFR-TKI联合RT可能有效减少或消除NSCLC BM EGFR-TKI耐药克隆。未来评估真实世界NSCLC BM患者群体将明确CSF cfDNA的预测价值。

参考文献：

Qiao S, Hao Y, Cai L, Duan X, Wang L, Zhou A, Zhu X. Prognostic value of cell-free DNA in cerebrospinal fluid from lung cancer patients with brain metastases during radiotherapy. Radiat Oncol. 2023 Mar 11;18(1):50. doi: 10.1186/s13014-023-02239-y. PMID: 36906568; PMCID: PMC10007729.

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