椎间盘退变（IVDD）总是伴随着活性氧（ROS）的过度积累，继而导致髓核细胞（NPCs）的衰老和线粒体功能的进行性恶化。值得注意的是，非免疫细胞中ROS的主要产生位点是线粒体，这表明线粒体是一种可行的逆转IVDD的治疗靶点。三苯基溴化磷（TPP）作为一种线粒体嗜性配体，常用于线粒体靶向相关材料修饰及改性。然而，其在椎间盘退变方向上的应用极少。因此，扬州大学陈昊/王辉辉/固始县妇幼保健院骨科曹志鹏在之前的研究基础上，利用TPP来修饰碳点-普鲁士蓝（CD-PB），合作开发了一种兼具线粒体靶向及高效抗氧化类酶活性的新型纳米材料（CD-PB-TPP），并将其应用于IVDD的治疗研究中。该研究以题为“Rescuing Nucleus Pulposus Cells from ROS Toxic Microenvironment via Mitochondria-Targeted Carbon Dot-Supported Prussian Blue to Alleviate Intervertebral Disc Degeneration”的论文发表在《Advanced Healthcare Materials》上。

在该项研究中，CD-PB-TPP可以有效地逃脱溶酶体的吞噬作用，从而实现出色的线粒体靶向效应。CD-PB-TPP通过发挥超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶样活性，显著降低线粒体内的ROS，在体外挽救受损的线粒体功能并抑制NPCs内的衰老、分解代谢和炎症反应水平。体内影像学和组织学评估结果显示，局部应用CD-PB-TPP后，IVDD模型的椎间盘高度指数（DHI）、髓核组织平均灰度值（MGVs）和组织学形态均有显著改善，证实了CD-PB-TPP在退变椎间盘中的治疗作用。总而言之，该项研究开发出一种新型线粒体靶向碳点-普鲁士蓝纳米酶，可以通过有效清除ROS来挽救其诱导的NPCs内线粒体功能障碍和衰老，为临床治疗IVDD提供了潜在的策略。

示意图：CD-PB-TPP通过高效靶向线粒体，清除线粒体内ROS抑制髓核细胞衰老以延缓椎间盘退变。

【CD-PB-TPP的材料学表征及抗氧化类酶活性检测】

合成的CD-PB-TPP经纯化后，对其基本性质进行表征和分析。透射电子显微镜(TEM)图像显示CD-PB-TPP主要为不规则颗粒状形貌，其直径约为60nm，分子量小，更容易被细胞吸收。此外，元素映射结果证实了C、N、O、Fe、P元素在CD-PB-TPP上的均匀分布。通过分析傅里叶变换红外光谱（FT-IR）显示CD-PB-TPP和PB，CD-PB在2058 cm^-1附近有着相似的特征峰，这可能是氰基（-CN-）拉伸所致，说明CD-PB-TPP上存在普鲁士蓝的特异性结构性质。此外，CD-PB-TPP在1109 cm⁻¹附近出现了相应的振动峰（C-P），表明TPP成功接入CD-PB。同样地，X射线粉末衍射（XRD）及XPS数据也表明CD-PB-TPP的成功合成。

此外，合成的CD-PB-TPP具有多种抗氧化类酶活性，包括SOD酶活，CAT酶活，总抗氧化能力，羟自由基清除作用等，显示出卓越的ROS清除能力。相对于CDs和PB而言，CD-PB-TPP和CD-PB的抗氧化类酶活性，羟自由基清除能力及总抗氧化能力明显得到提升，二者抗氧化能力相近，表明TPP的接入并不会干扰CD-PB的ROS清除能力。此外，额外的线粒体靶向作用使得CD-PB-TPP有望缓解退行性椎间盘疾病中严重的ROS微环境。

图1. CD-PB-TPP的材料学表征

图2. CD-PB-TPP的抗氧化类酶活性测定

【CD-PB-TPP的线粒体靶向和氧化应激保护作用的验证】

为了探究CD-PB-TPP的线粒体靶向能力，NPCs分别与FITC绿色荧光标记的CD-PB和CD-PB-TPP孵育1天，然后利用Lyso-Tracker及Mito-Tracker红色荧光探针分别进行溶酶体及线粒体染色。荧光共定位染色结果显示，与CD-PB相比，CD-PB-TPP可以实现溶酶体逃逸，从而更加高效地靶向至线粒体。敲定CD-PB-TPP的体外安全浓度后，通过细胞毒性及活死细胞染色等实验的验证，发现CD-PB和CD-PB-TPP均能挽救H₂O₂诱导的髓核细胞氧化应激损伤，且与CD-PB相比，同浓度的CD-PB-TPP治疗效果更加显著。此外，CD-PB-TPP可在体外清除细胞内过量的ROS，维持线粒体的稳态并抑制髓核细胞的衰老。髓核细胞的衰老过程往往还会伴随促炎因子、基质金属蛋白酶（MMPs）等衰老相关分泌表型（SASP）的大量分泌。令人满意的是，CD-PB-TPP可以有效抑制NPCs内炎症因子表达、分解代谢过程，促进合成代谢过程。

图3. CD-PB-TPP在NPCs内的亚细胞定位和生物相容性

图4. CD-PB-TPP通过清除过量的ROS来挽救髓核细胞的衰老和线粒体损伤

图5. CD-PB-TPP重建分解代谢及合成代谢平衡，以维持髓核细胞稳态

【体内逆转椎间盘退变的作用】

为评价CD-PB-TPP对椎间盘的体内保护作用，体内实验则采取尾椎针刺法，建立大鼠椎间盘退变的模型，采用X射线、MRI影像学检查和椎间盘石蜡切片组织染色，实验结果表明局部注射CD-PB-TPP可在使大鼠椎间盘高度和髓核含水量得到恢复，从而达到延缓椎间盘退变的作用。为了进一步验证CD-PB-TPP在体内的抗氧化、抗衰老及抗炎作用，还提供了大鼠椎间盘组织切片的各项免疫荧光染色结果。

图6. 局部注射CD-PB-TPP可在体内有效逆转IVDD

【在体内的代谢和生物相容性】

虽然已经初步验证CD-PB-TPP具有良好的清除ROS的能力，但其在体内的长期积累也有可能有潜在的毒副作用。其生物学效应后的代谢模式及其对身体其他器官的影响尚未研究。通过跟踪其在健康小鼠体内的荧光强度，研究了CD-PB-TPP在健康小鼠体内的药代动力学行为。尾静脉注射CD-PB-TPP后，其被吸收入血到达重要器官。体内成像显示CD-PB-TPP在小鼠体内注射后24h几乎检测不到荧光，表明CD-PB-TPP主要经肾脏途径完全代谢。各项血液生化指标均在正常范围内，说明CD-PB-TPP的体内血液毒性可忽略不计。小鼠心、肝、脾、肺、肾也均未见病变。这些结果共同说明CD-PB-TPP在体内代谢迅速，无明显的生物毒性。

图7. CD-PB-TPP的体内生物相容性及代谢途径

【小结】

综上所述，此新型CD-PB-TPP纳米酶具有制备工艺简单、抗氧化类酶活性高、生物相容性好等特点，此外，CD-PB-TPP还具备出色的线粒体靶向作用，可以有效抵达ROS聚集的亚细胞单位——线粒体。因此，CD-PB-TPP在体外能够有效清除过量的ROS，发挥维持线粒体稳态、抑制髓核细胞衰老的作用，并在体内实验中进一步验证了其逆转大鼠尾部穿刺变性模型IVDD进展的作用，可初步认为其具有较大的研究价值和临床转化潜力。本研究为IVDD的治疗提供了新的理论基础。此外，鉴于CD-PB-TPP出色的抗氧化作用，它在其他疾病模型中可能也具有潜在的应用价值。本研究得到了中国国家自然科学基金、江苏省自然科学基金和扬州大学创新团队项目的资助。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202303206

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