1 肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法概述

TIL是指存在于肿瘤实质和肿瘤间质内的以T淋巴细胞为主的一类异质性淋巴细胞群体，主要由T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞和髓源性抑制细胞等组成^[1]。其中，负载肿瘤抗原特异性T淋巴细胞受体(TCR) 的CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是最重要的抗肿瘤效应淋巴细胞。其细胞表面的TCR特异性识别靶细胞膜主要组织相容性复合体1类分子提呈的肿瘤新抗原后，通过分泌穿孔素溶解破坏靶细胞结构，以及高表达Fas配体、增加合成与释放IFN-γ与肿瘤细胞相应受体结合激活肿瘤细胞凋亡等方式，起到杀伤肿瘤细胞的作用^[2-3]。同时，CD8⁺T淋巴细胞在激活后随即调高包括PD-1的抑制性免疫检查点分子膜表达，而IFN-γ诱导肿瘤细胞高表达PD-L1，其与CD8+T淋巴细胞膜PD-1结合后使其成为功能受损的耗竭效应细胞，最终产生免疫逃逸^[4]。研究^[5-6]发现，PD-1⁺CD8⁺细胞占TIL中的多数，且比例明显高于正常组织及外周血。更重要的是，肿瘤特异性识别CD8⁺T淋巴细胞的PD-1表达水平经过体外培养后下降。这提示PD-1高表达TIL经过体外培养，能够改变其耗竭状态，恢复抗肿瘤功能。以上发现为自肿瘤组织内分离出TIL，经体外扩增后回输给患者以治疗肿瘤提供了理论基础。

美国国家癌症研究所Rosenberg团队^[7]最早从多种小鼠肿瘤模型中分离出TIL，并联合IL-2治愈了100%的结肠腺癌负瘤肝转移小鼠和50%的肺转移小鼠，为TIL的临床应用提供了基础理论依据^[8]。此外，该团队在1986年证实黑色素瘤患者手术切除肿瘤组织里也存在浸润淋巴细胞，并在1988年首次用自体TIL治疗1例恶性黑色素瘤并致肿瘤消退，开创了TIL疗法。随后，该团队又进行了多次临床试验。最具有代表性的是一项纳入93例伴远处转移的恶性黑色素瘤患者的研究，研究使用3种淋巴细胞清除预处理方案(单独化疗、2 Gy或12 Gy全身照射)的TIL治疗，分别获得了49%、52% 和72%的客观缓解率(ORR)，其中20例(22%)患者实现了完全缓解(CR)，并且有19例患者的CR超过3年^[9]。由于TIL疗法的出色疗效，该团队研发的TIL(LN-145，Iovance公司，美国)于2019年5月被美国食品药品监督管理局授予突破性疗法认定。

TIL疗法即基于TIL的过继性细胞治疗，是将获取的肿瘤组织消化和分离出浸润淋巴细胞，经体外培养活化和扩增后，将高达1×10¹¹的细胞回输到患者体内杀伤肿瘤细胞。在输注TIL之前采用化疗或全身照射的非清髓性淋巴细胞清除预处理，淋巴细胞清除后可以经由不同机制提高TIL的肿瘤细胞杀伤效率^[8]。鉴于IL-2是刺激T淋巴细胞增殖与存活的重要细胞因子，Rosenberg等^[10]于1988年开始将IL-2联合TIL疗法应用于抗肿瘤治疗并获得成功。因此，清淋化疗预处理与细胞回输后大剂量IL-2输注给药是目前TIL治疗恶性肿瘤的经典组合方案。同时，这两种辅助治疗也被认为是TIL治疗相关不良反应的主要来源。

众所周知，CAR-T治疗血液肿瘤已取得显著疗效。但实体瘤的高度异质性使得针对单一肿瘤靶点不可避免地会导致抗原丢失和/或携带原突变深度有限而难以靶向新抗原的肿瘤细胞成为优势亚群，从而导致疾病进展或复发。而且，即使过继性输注大量T淋巴细胞，由于缺乏特异性肿瘤细胞识别性和对于肿瘤组织的趋化能力而难以有效浸润到多数实体瘤组织内。同时，肿瘤微环境中存在的各种免疫逃逸机制(如PD-1/PD-L1和CTLA-4) 和抑制性细胞[如调节性T淋巴细胞(Treg)和髓源性抑制细胞]的负向调节机制，亦难以克服, 使得输注的T淋巴细胞很难发挥抗肿瘤效应^[11]。对于上述实体肿瘤细胞治疗的瓶颈，TIL则表现出独特的优势。

首先，TIL已经过肿瘤细胞的滤过性筛选而具有高度异质性肿瘤新抗原的多靶点识别性，其TCR克隆亚群对于肿瘤细胞特异识别率可达40%以上^[12]，故适用于高突变负荷的实体瘤(如黑色素瘤等)。其次，由于主要成分为表达趋化因子受体的效应记忆T淋巴细胞，因此TIL在回输至患者体内后易于在与肿瘤抗原特异性TCR共同作用下定位于肿瘤组织内。此外，与CAR-T肿瘤细胞治疗不同的是，TIL疗法目前尚未有出现自身免疫毒性反应的报道，这是因为TIL是凭借其特异性识别TCR靶向肿瘤MHC提呈的体细胞基因突变新抗原产物，而这些新抗原不会被机体生理组织细胞所提呈，因此不会产生“脱靶”效应^[13]。

2 TIL在实体肿瘤治疗中的应用

目前，TIL疗法在实体瘤中主要作为二线治疗开展临床试验。黑色素瘤仍是多数临床试验的主要适应证，其次是非小细胞肺癌(NSCLC)、宫颈癌等。根据2021年美国临床肿瘤学会(ASCO)公布的数据(NCT02360579)，截至2021年4月，TIL疗法治疗终末期黑色素瘤的ORR为36.4%，疾病控制率(DCR)高达80.3%，其中66例(包括PD-L1阴性) 受试者的中位反应时间已超过33.1个月。同年公布的在科罗拉多大学实施的另一项研究(NCT03645928)数据表明，TIL联合PD-1抑制剂帕博利珠单抗治疗7例PD-1单抗耐药的黑色素瘤患者，在8.2个月的中位随访期内ORR达86.0%(CR 43.0%)，这一结果初步证实了TIL在PD-1单抗耐药的黑色素瘤患者中的治疗反应性，并提示或可考虑将TIL作为该癌种的早期治疗选项。对于NSCLC，2021年11月癌症免疫治疗学会(SITC)公布了TIL (LN-145)单次给药治疗复发/难治性NSCLC患者的数据(NCT03645928)：中位随访期8.2个月，ORR为21.4% [n=28，CR 1例和部分缓解(PR)5例]，DCR为64.3%，中位缓解持续时间未达到。值得注意的是，治疗期间出现的不良事件均为基础疾病和已知的非清髓性化疗预处理及IL-2用药所致。Ratto等^[14]报道了TIL联合放疗对比化疗联合放疗对113例NSCLC的疗效，发现对于Ⅲ A期和Ⅲ B期患者，TIL联合放疗组的生存时间均显著高于化疗联合放疗组，中位生存期分别为22.0个月vs 9.9个月(P=0.06)和23.9个月、7.3个月(P＜0.01)。

同时，TIL疗法在宫颈癌中也获得疗效。根据2021年SITC公布的数据^[15]，TIL (LN-145) 联合帕博利珠单抗治疗14例复发性或转移性宫颈癌患者获得了57.1%的ORR和92.9%的DCR，其中1例受试者达到CR，85.7%的受试者肿瘤负荷降低。Stevanovi c ' 等^[16]研究了TIL治疗转移性宫颈癌的效果，ORR为33.3%(n=9，CR 2例和PR 1例)，其中2例CR分别持续了22.0和15.0个月。此外，TIL在卵巢癌、头颈部恶性肿瘤等治疗中也取得了初步成果。以上研究结果证实了TIL疗法可以使部分种类的恶性实体肿瘤患者，特别是常规治疗耐药的难治性患者，从基于TIL的过继性细胞免疫治疗获益。

3 TIL在胆道癌中的应用

胆道癌包括肝内胆管癌、肝外胆管癌以及胆囊癌。肝内胆管癌被认为是仅次于肝细胞癌的原发肝内恶性肿瘤，发病率约占原发性肝恶性肿瘤的10%~15%^[17]。根治性手术切除或肝移植是迄今为止唯一可治愈的手段。然而据报道，根治性手术后复发率高达50%^[18]。与健康的肝脏相比，肝内胆管癌肿瘤组织中CTL和NK细胞的比例较低，但Treg的比例较高^[19]。最常见的炎症细胞类型是T淋巴细胞，其中CD8⁺ T淋巴细胞占大部分。B淋巴细胞和NK细胞的数量则较低^[20]。CD8⁺T淋巴细胞和非Treg CD4⁺ T淋巴细胞主要浸润于肝内胆管癌肿瘤组织的周边区域，而Treg则常常浸润到肿瘤组织核心区域内^[21]。一般认为，CD8⁺和CD4⁺T淋巴细胞以及CD20⁺B淋巴细胞与肝内胆管癌的肿瘤学预后指标呈正相关，而大量Treg很可能与较差的总生存期相关^[22]。Oshikiri等^[23]在58例肝外胆管癌手术切除标本中发现32例(55%) 存在CD8⁺T淋巴细胞浸润，且肿瘤内CD8⁺T淋巴细胞是预测患者生存率增加的可靠指标。如上所述，胆道癌根据是否存在免疫细胞浸润可分为存在与缺乏淋巴细胞浸润两类^[24]，即免疫“热”型和“冷”型。总体而言，胆道癌被倾向于界定为低CD8⁺T淋巴细胞丰度的“冷肿瘤”，即是大多数效应T淋巴细胞被隔离在肿瘤边缘的免疫排斥性肿瘤^[19, 25-26]。临床观察也发现，与黑色素瘤、肾细胞癌、NSCLC和结肠腺癌等其他肿瘤相比，多数研究晚期胆道癌免疫疗法的临床试验未达到满意的疗效^[27]。因此，能否成功地从胆道癌肿瘤组织中获得足够的浸润淋巴细胞用以制备TIL是高度个体化的，在未能获得肿瘤组织淋巴细胞浸润定量证据的前提下，TIL在胆道癌中的抗肿瘤作用仍难以预测^[23]。

TIL的检测与分析已被用于对于胆道癌的评估。Yoon等^[28]于2021年发表了121例晚期胆道癌患者(肝内胆管癌68例，胆囊癌41例，Vater壶腹癌12例)的基因组测序与临床疗效的相关性分析，发现KRAS改变和染色体不稳定与PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗耐药相关，这类患者中95.0%接受治疗后未观察到临床获益。同时，还发现这些患者肿瘤组织中TIL密度低下，表明存在免疫抑制性的肿瘤微环境和免疫原性被削弱。相比之下，肿瘤内TIL密度高的患者则对免疫治疗反应良好。另一方面，一项包含308例胆道癌患者的队列研究^[29]发现，受高水平微卫星不稳定性(MSI-H) 影响的患者大多具有非典型组织形态学，显示出更长的总体生存期和更高数量的CD8⁺ T淋巴细胞、FOXP3⁺ Treg细胞、CD20⁺ B淋巴细胞。这些数据表明，肿瘤体细胞突变分析结果和基因组稳定性标志物与胆道癌的TIL浸润程度存在相关性，并可用于预测免疫治疗后的病情转归。

由于TIL疗法在很大程度上取决于对新抗原的识别，可能被TIL的TCR直接特异性靶向的基因组研究同样具有重大的临床应用价值。一项对260例胆道癌患者肿瘤组织的基因组谱系研究揭示了包括新的潜在治疗靶点的基因组改变谱。在胆囊癌和肝外胆管癌中观察到具有较高APOBEC相关突变特征负荷的突变特征的梯度谱。包括ELF3在内的32个显著改变的基因被鉴定出来，近40%的病例具有靶向遗传改变。涉及FGFR2和PRKACA或PRKACB的基因融合分别优先发生在ICC和肝外胆管癌中^[30]。这些发现为TIL的肿瘤识别性提供了特异性靶点。

迄今为止公布的基础研究结果为TIL疗法提高胆道癌患者的常规治疗获益提供了依据。Sawasdee等^[31]在使用吉西他滨与CTL联合治疗吉西他滨耐药的胆道癌细胞体外研究中，发现联合治疗增加了DC细胞激活的T淋巴细胞对耐药胆道癌肿瘤细胞的杀伤活性，分析可能是由于HLA Ⅰ类分子的诱导上调改变了抗原呈递过程，从而增进了CTL细胞毒性功能。除化疗外，对肿瘤免疫治疗的体外研究也发现了相似的现象。Morisaki等^[32]用西妥昔单抗培养细胞因子激活的杀伤细胞，发现联合用药显著增强了细胞毒性，并发现这种增强效应被反应体系内加入的人免疫球蛋白所抑制，表明被激活的NK细胞以抗体依赖性作用方式提高了细胞毒性。这些体外研究和动物模型的研究结果证实了抗肿瘤药物直接或间接影响TIL的作用功能，并可能助益胆道癌的临床免疫治疗，并可作为未来临床转化的理论依据。

尽管目前尚无以TIL为代表的过继性细胞治疗应用于胆道癌单一病种的临床队列报道，但近期的多癌种临床报道提供了少数接受TIL治疗的胆道癌患者疗效信息。Kverneland等^[33]于2021年报道了应用CTLA-4单抗与纳武单抗联合常规TIL疗法(结合清淋化疗预处理与大剂量IL-2) 治疗包括10个癌种的25例患者的疗效。入组患者中的5例胆道癌于治疗后观察到了30%~63%的肿瘤消退。其中，3例以肺部转移为靶病灶的患者中，1例的胸膜下小结节病灶显著消退，评估为PR (无进展生存期为199天，总生存期为870天)，其他2例患者获肿瘤稳定的治疗反应。由于该临床研究包括的胆道癌病例较少，达到ORR的病例靶病灶较小且不存在其他远处转移病灶，因而尚有待更多病例治疗后反应数据的发布，以提供从TIL治疗中实际获益有说服力和代表性的结论。

为了实现TIL对胆道癌新抗原的可靠识别性，Rosenberg团队分析全外显子组测序HLA Ⅰ类分子的数据鉴定和分选肿瘤细胞表达的体细胞突变肽，并将这些突变表位导入MHC匹配的抗原呈递DC细胞，将其与Young TIL共培养，再通过ELISPOT分析IFN-γ的合成与分泌机能，分选出新抗原特异性CD8⁺T淋巴细胞，在体外大量扩增后给予患者回输治疗。使用这样的技术路径，Rosenberg团队通过获取1例胆道癌患者手术病理组织，从分选获得的TIL中鉴定出可以识别ERBB2IP突变的MHC Ⅱ抗原HLA-DQO6限制性CD4⁺T淋巴细胞。富集了95%以上ERBB2IP突变的反应性CD4⁺T淋巴细胞的TIL回输后诱导了患者肝和肺多发转移灶的显著消退。这表明肿瘤抗原特异性CD4⁺T淋巴细胞与CD8⁺CTL一样，能够在一定条件下发挥关键的抗肿瘤免疫作用^[34]。

4 TIL治疗胆道癌的困境和未来发展方向

使用上述技术获得的新抗原特异性效应TIL的显著疗效还见于黑色素瘤与结直肠癌患者的治疗^[35-36]。然而，这种方法需要付出高昂的成本、冗长的细胞制备周期、复杂的专用设备等代价，因而尚未广泛应用于临床。

TCR的高度多样性、优异的浸润肿瘤部位的能力以及TIL的低毒性是TIL疗法相对于其他过继性细胞治疗的优势。然而，TIL疗法仍面临严峻挑战。除生产成本与周期等条件的限制外，TIL治疗后肿瘤反应性也有待更多的临床研究结果作为评估的依据。

TIL过继性回输与其他抗肿瘤方法学的联合应用已证实能够提高恶性肿瘤患者的治疗获益。与前述体外研究结果相一致，放疗、化疗与TIL联合治疗已分别在头颈部癌与卵巢癌的治疗中显示出患者获益的提升^[37-38]。因此改进TIL治疗体系，以提高传统TIL疗法的性能与适用性是未来研究的主要策略。采用基因编辑技术敲除TIL的PDCD1基因可防止其与肿瘤微环境中的PD-L1结合并增加TIL功能^[39]。有报道表明，改造TIL以过度表达细胞因子(如IL-2和IL-12)，使治疗细胞在肿瘤组织内维持高细胞因子水平，可以提高抗肿瘤活性和生存期^[40]。类似的改进还包括使用趋化因子CXCR2逆转录病毒转导TIL (NCT01740557)，以强化治疗细胞趋化定位于肿瘤组织内部的能力^[41]。然而这些技术改进能否提高TIL针对胆道癌患者的疗效，还需要相关的临床研究加以验证。

TIL疗法在胆道癌的临床应用条件则更为复杂，胆道癌患者免疫微环境异质性强，不同患者免疫微环境差异很大。根据肿瘤微环境中免疫细胞浸润的差异性将肿瘤免疫微环境分为3种^[42]：(1)免疫炎症型(Inflamed)：肿瘤组织周围浸润了较多的免疫细胞，但其中一部分细胞处于免疫抑制状态；(2)免疫阻隔型(Immune Excluded)：肿瘤相关成纤维细胞及胞外基质所形成的致密的基质屏障，阻隔免疫细胞浸润到肿瘤细胞周围；(3)免疫沙漠型(Immune Desert)：免疫细胞远离肿瘤细胞，微环境几乎没有免疫细胞浸润。胆道癌组织中尽管突变负荷和免疫原性较高，但肿瘤微环境高度免疫抑制。胆道癌免疫微环境浸润有大量抑制性固有免疫细胞，包括髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关中性粒细胞等^[19, 25-26]。T淋巴细胞一般浸润在肿瘤组织周围，难以进入肿瘤组织中心区域；另外，浸润T淋巴细胞常常处于功能耗竭状态。这些特征导致胆道癌患者的免疫系统难以持续长期发挥抗肿瘤免疫效应。针对胆道癌免疫微环境特征，建立更加精准的分型方法，细分不同临床治疗方案适应人群，对提高胆道癌的整体治疗应答率尤为重要。

TIL作为针对恶性实体肿瘤设计的过继性免疫细胞治疗体系，已在恶性黑色素瘤等免疫细胞富集程度高的“热肿瘤”治疗中获得优异疗效，拓展适应癌种的临床实践也正在探索中。在Rosenberg等创始的“标准”组织TIL的“三件套”疗法基础上尝试与不同抗肿瘤药物的联合治疗和采用新技术修饰免疫细胞等努力，将有助于克服TIL在细胞作用机制与制备等方面的各种固有限制，扩展TIL治疗体系的易用性和适应病种，并提高以胆道癌为代表的免疫排斥性恶性实体肿瘤患者应用TIL治疗的临床获益。

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万雪帅, 谢小兵, 赵海涛, 等. 肿瘤浸润淋巴细胞治疗胆道癌研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2023, 39(5): 1030-1036

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